Transfección de ameba de tipo salvaje mediante electroporación con apoyo de alimentación bacteriana

Resumen

Fuente: Paschke, P., et al. Ingeniería genética de células de Dictyostelium discoideum basada en la selección y el crecimiento de bacterias. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra el procedimiento para introducir un plásmido que lleva un gen diana en las células de la ameba mediante electroporación, seguido de la recuperación en un suplemento bacteriano para permitir la administración eficiente de genes en amebas de tipo salvaje.

Protocolo

1. Configuración de células de Dictyostelium para la transfección
   1. Cultive Klebsiella aerogenes hasta la confluencia en medio SM (leche descremada) (medio rico en nutrientes) durante la noche a RT (temperatura ambiente). Los cultivos se pueden almacenar hasta 2 semanas a 4 °C.
   2. Agregue aproximadamente 400 μL de esta suspensión bacteriana en una placa de agar SM (peptona 10 g / L; extracto de levadura 1 g / L; glucosa 10 g / L; KH₂PO₄ 1,9 g/L; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1,3 g/L; MgSO:₄ anhidro: 0,49 g/L; 1,7% agar) y esparcir uniformemente. Tome un asa estéril e inocule con células de Dictyostelium . Extienda las células en un borde de la placa.
   3. Incube la placa a 22 °C durante 2 días para asegurar zonas de crecimiento suficientemente grandes para la transfección.
      NOTA: Para cepas de Dictyostelium que no forman grandes zonas de crecimiento (por ejemplo, Ax3, DH1 o JH10), o para experimentadores sin experiencia, use placas de limpieza en su lugar.
   4. Tome un asa estéril e inocule con células de Dictyostelium (aproximadamente 2-4 x 10⁵ células). Transfiera las células a 800 μL de una suspensión densa de K. aerogenes en SM. Mezcle las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   5. Transfiera 400 μL, 200 μL, 100 μL y 50 μL en placas de agar SM frescas. Agregue a cada placa 400 μL de suspensión adicional SM K. aerogenes , extienda uniformemente y seque.
   6. Incubar las placas a 22 °C durante unos 2 días hasta que las placas se vuelvan translúcidas.
      NOTA: Debido a su tasa de crecimiento más rápida, las bacterias inicialmente producen un césped confluente y las amebas posteriormente "limpian" la placa de las bacterias. El tiempo requerido para este proceso puede diferir según el fondo de la cepa y la capacidad de las células mutantes para crecer en bacterias.

2. Transfección de células de Dictyostelium basada en la selección bacteriana

1. Para preparar placas con suspensión de K. aerogenes , agregue 10 ml de tampón SorMC que contenga bacterias K. aerogenes a una densidad de OD (densidad óptica) ₆₀₀ = 2 (agregue 200 μl de la solución madre preparada OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes para la concentración deseada de bacterias) en una placa de Petri tratada con cultivo de tejidos de 10 cm.
   NOTA: Esta placa se necesita más tarde para cultivar las células de D. discoideum transfectadas. Alternativamente, se puede utilizar una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. En el caso de la transfección de los plásmidos extracromosómicos, la placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos es más eficiente en cuanto a recursos. Use 2 ml de suspensión de K. aerogenes SorMC (OD₆₀₀ = 2) por pocillo.
2. Preparación de células de Dictyostelium
   1. Con un asa de inoculación desechable de 10 μl, raspe las células de las zonas de crecimiento (aproximadamente 3 cm) de la placa de cultivo (borde del área despejada) o la placa de limpieza. Transfiera las células a un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de tampón H40 helado.
      NOTA: El momento de recolectar células de las placas de limpieza es crucial. La cosecha demasiado temprana produce una cantidad demasiado pequeña de células, mientras que la cosecha demasiado tardía aumenta el riesgo de producir células parcialmente desarrolladas.
   2. Lave las células centrifugando durante 2 min a 1.000 x g o centrifugando rápidamente durante 2 s a 10.000 x g. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el tampón H40 a una densidad final de 2-4 x 10⁷ células/ml. Mantenga las células frías durante todo el procedimiento de transfección. Use una suspensión de agua helada para asegurar el contacto directo de los tubos y el hielo.
3. Electroporación
   1. Agregue 100 μL de células a un tubo con 1-2 μg de ADN (ácido desoxirribonucleico). Mezclar cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   2. Transfiera la mezcla de célula / ADN a una cubeta de electroporación preenfriada (espacio de 2 mm).
   3. Pulse las celdas utilizando los siguientes ajustes de onda cuadrada: 350 V, 8 ms, 2 pulsos e intervalo de pulso de 1 s.
      NOTA: No agregue más de 2 μg de ADN. Las cantidades más altas son tóxicas para las células y disminuyen la eficiencia de la transfección. El volumen total de ADN añadido no debe exceder los 5 μL.
   4. Transfiera las células inmediatamente a la placa de Petri de 10 cm preparada anteriormente con K. aerogenes SorMC y deje que las células se recuperen durante 5 h.
      NOTA: Revise las células en la placa de Petri bajo un microscopio invertido. Las células aparecerán redondas directamente después de la electroporación, pero volverán a su forma ameboide después de unos 30 minutos, cuando hayan tenido tiempo suficiente para adherirse correctamente a la superficie.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microcentrífugas Eppendorf 5424/5424R	ThermoScientific	05-400-002
Centrífugas Eppendorf 5702R con rotor modelo A-4-38	ThermoScientific	12823252
Armario de seguridad Foruna - SCANLAF	Labógeno
Biofotómetro Plus	Eppendorf
CLSM 710	Zeiss
Agar purificado	Oxoide	LP0028
Caldo SM	Formedium	SMB0102
2x LB de caldo	Formedium	LBD0102
Ácido libre HEPES	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	P/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	Sigma Aldrich	442909
Ácido fólico	Sigma Aldrich	F7876
KOH	VWR	26668.263
Plato de cultivo de tejidos estilo 100 x 20 mm, tratado con cultivo de tejidos	Corning Incorporado	353003
Cubetas de electroporación de 2 mm de espacio, electrodo largo	Geneflow Limited	E6-0062
Asa de inoculación de 10 μl, azul 10 Micro L	ThermoScientific	129399
Esparcidor, en forma de L, estéril	Greiner Bio-One	730190