Visualización de interacciones bacterianas unicelulares

Resumen

Fuente: Yarringto, K. D., et al. Visualización cinética de interacciones bacterianas entre especies unicelulares. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la preparación de un sistema de cocultivo utilizando bacterias móviles y no móviles debajo de una almohadilla de agarosa para imágenes de células vivas. Muestra cómo las bacterias móviles detectan atrayentes químicos e invaden colonias inmóviles, revelando interacciones bacterianas.

Protocolo

1. Preparación de células bacterianas y almohadillas de inoculación

1. Mida la densidad óptica, OD₆₀₀, de cada subcultivo y diluya Pseudomonas aeruginosa a un OD₆₀₀ = 0.03 y Staphylococcus aureus a un OD₆₀₀ = 0.10 en M8T (Medio mínimo 8 + triptona) precalentado a 37 ° C. Mezcle P. aeruginosa y S. aureus en una proporción de 1: 1 y vórtice.
   NOTA: Si las cepas requieren antibióticos, se pueden agregar a la pernoctación y al subcultivo, pero no deben agregarse al mezclar especies para obtener imágenes si afectan a las otras especies en el cocultivo. La estabilidad del plásmido y los efectos de los antibióticos en todas las especies del cocultivo deberán determinarse para cada organismo/plásmido que se utilice.
2. Pipetear 1 μL de cocultivo uniformemente en el fondo de una placa de cubreobjetos de vidrio estéril de 35 mm precalentada.
3. Retire el recorte de silicona del molde con unas pinzas estériles.
4. Retire la almohadilla del plato con espátulas estériles.
   1. Deslice la espátula ligeramente doblada debajo del borde de la almohadilla mientras sostiene el molde boca abajo para dejarlo caer sobre una tapa de placa de Petri estéril.
      NOTA: No fuerce la almohadilla hacia afuera, o se romperá. Lleve un registro de qué lado de la almohadilla es la parte inferior.
5. Transfiera la almohadilla al plato con las células bacterianas, con la parte inferior hacia abajo, deslizando la espátula en ángulo de 90° debajo de la almohadilla y colocándola encima del cubreobjetos inoculado. Use la espátula en ángulo de 90 ° para hacer que la almohadilla quede al ras contra el cubreobjetos y presione suavemente las burbujas de aire.
6. Retire el exceso de humedad de las toallitas húmedas y colóquelas alrededor del borde del plato, asegurándose de que no toquen la almohadilla. La muestra ahora está lista para la obtención de imágenes.

Materiales