Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas mediante separación de fases con detergente no iónico

Resumen

Fuente: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminales para la determinación estructural por espectrometría de masas. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas utilizando un detergente no iónico que se somete a separación de fases al calentarse. A través de cambios secuenciales de temperatura y pasos de centrifugación, las lipoproteínas se dividen selectivamente en la fase detergente, mientras que los contaminantes no lipoproteicos se eliminan. Las lipoproteínas enriquecidas se precipitan, se lavan y se vuelven a suspender para aplicaciones posteriores.

Protocolo

1. Enriquecimiento de lipoproteínas mediante partición de fase Triton X-114 (TX-114)

1. Complemente el lisado bacteriano con tensioactivo TX-114 hasta una concentración final del 2% (vol/vol) añadiendo un volumen igual de tensioactivo al 4% (vol/vol) en solución salina tamponada con Tris/ácido etilendiaminotetraacético (TBSE) helado e incube en hielo durante 1 h, mezclando por inversión cada ~15 min.
   NOTA: Cuando se enfríen, el sobrenadante y el tensioactivo serán miscibles.
2. Transfiera el tubo a un baño de agua a 37 °C e incube durante 10 min para inducir la separación de fases. Centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente para mantener la separación bifásica.
3. Pipetear suavemente la fase acuosa superior y desechar. Agregue TBSE helado a la fase de surfactante inferior para rellenar el tubo a su volumen original e invertirlo para mezclar. Incubar en hielo durante 10 min.
4. Transfiera el tubo a un baño de agua a 37 °C e incube durante 10 min para inducir la separación de fases, luego centrifugue a 10.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
5. Repita los pasos 1.3-1.4 una vez más para un total de 3 separaciones. Retire la fase acuosa superior y deséchela.
6. Elimine el gránulo de proteínas precipitadas que se formaron durante el curso de las extracciones (visible en el fondo del tubo), agregando 1 volumen de TBSE helado a la fase de surfactante. Centrifugar a 4 °C a 16.000 x g durante 2 min para granular la proteína insoluble.
   NOTA: La muestra debe seguir siendo una sola fase. Si se produce una separación de fases, vuelva a enfriar la muestra y centrifugue nuevamente. El gránulo generalmente está compuesto de contaminantes no lipoproteicos, pero se puede retener para un análisis posterior.
7. Transfiera inmediatamente el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo de 2,0 ml que contenga 1250 μl de acetona al 100%. Pipetea hacia arriba y hacia abajo a fondo para lavar la muestra de la punta, ya que será viscosa. Mezclar por inversión e incubar durante la noche a -20 °C para precipitar la proteína.
8. Centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 20 min a temperatura ambiente para granular lipoproteínas con atención a la orientación del tubo. Las lipoproteínas formarán una película delgada y blanca a lo largo de la pared exterior del tubo.
9. Lave el gránulo dos veces con acetona 100%. Decantar acetona y dejar secar la muestra al aire.
10. Añadir 20-40 μl de clorhidrato de tris de 10 mM, pH 8,0 o un tampón de muestra SDS-PAGE estándar de Laemmli y volver a suspender completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo contra la pared con las lipoproteínas precipitadas. Raspe el costado del tubo con la punta de la pipeta para desalojar las lipoproteínas.
    NOTA: Las lipoproteínas no se disolverán en el tampón Tris, sino que formarán una suspensión.
    1. Almacenar las lipoproteínas a -20 °C hasta su uso.

Materiales