Purificación de proteínas de dominio P recombinantes derivadas de bacterias de norovirus humanos

Resumen

Fuente: Leuthold, M. M., et al. Producción de dominios sobresalientes de norovirus humanos en E. coli para cristalografía de rayos X. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra la purificación del dominio P del norovirus humano recombinante mediante cromatografía de exclusión por tamaño, destacando la separación de la proteína diana de las impurezas de mayor y menor peso molecular en función de la accesibilidad diferencial de los poros. El proceso se monitorea mediante absorbancia UV y se confirma mediante el análisis SDS-PAGE de fracciones eluidas.

Protocolo

1. 3er paso de purificación

1. Lave las bombas y tuberías del sistema de purificación HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) y preequilibre la columna SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) (consulte la lista de materiales) con GFB (tampón de filtración de gel).
2. Inyecte el dominio P en la columna a un caudal de 1 ml/min utilizando un superbucle (hasta 12 ml) o un bucle (hasta 3 ml), dependiendo del volumen de la muestra concentrada. Una vez finalizada la inyección, aumente el caudal a 2,5 ml/min.
3. A medida que aumenta el OD (densidad óptica) y el dominio P sale de la columna, recolecte fracciones de 1,5 ml. Verifique las fracciones usando SDS-PAGE con un gel al 12% (Figura 1A y 1B). Agrupe solo las fracciones más puras y concéntrese en ~ 3 mg / ml y ~ 8 mg / ml.
   Nota: Después de ~ 110 ml (volumen vacío), la mayoría de las impurezas se eluyen de una columna SEC con un volumen de lecho de 320 ml. El dominio P generalmente se eluye como un dímero. El tiempo/volumen de elución del dímero de dominio P depende del grado de preparación (pg) de la columna SEC.

Resultados

Figura 1. Resultados esquemáticos y representativos para el 3er paso de purificación.
Cromatograma de elución del dominio P utilizando SEC y el resultado correspondiente de SDS-PAGE. Los números negros indican las fracciones que se recoge...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ADN de dominio P	Tecnologías de la vida		Síntesis de genes GeneArt
Vivaspin 20	GE Healthcare	varios	corte de 10 kDa, 30 kDa y 50 kDa utilizados
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	Columna SEC