Purificación selectiva de una proteína bacteriana mediante cromatografía de intercambio iónico negativo

Resumen

Fuente: Kuo, T., et al. Purificación cromatográfica negativa en un solo paso de la proteína activadora de neutrófilos de Helicobacter pylori sobreexpresada en Escherichia coli en modo por lotes. J. Vis. Exp. (2016)

El video demuestra una técnica de cromatografía negativa para purificar una proteína asociada a la virulencia a partir de un lisado bacteriano. Mediante el uso de una resina cargada positivamente en una solución tamponada, las proteínas de la célula huésped se retienen selectivamente, mientras que la proteína diana casi neutra permanece libre y se recoge en el flujo continuo. Este método permite una separación y recuperación eficientes de la proteína diana para aplicaciones posteriores.

Protocolo

1. Expresión de HP-NAP recombinante en Escherichia coli (E. coli)

1. Prepare el plásmido pET42a-NAP que contiene la secuencia de ADN de la proteína activadora de neutrófilos de Helicobacter pylori (HP-NAP) de la cepa H. pylori 26695 como se describió anteriormente. Preparar los plásmidos que contienen la secuencia de ADN de HP-NAP con las mutaciones puntuales deseadas.
2. Transformar 10 ng de los plásmidos de ADN anteriores en células competentes para E. coli BL21 (DE3) mediante choque térmico durante 45 segundos a 42 °C, rayar las células en placas de agar de caldo de lisogenia (LB) que contengan 50 μg/ml de kanamicina e incubar las placas a 37 °C durante 16 horas.
3. Inocular colonias individuales en tubos individuales que contengan 5 ml de caldo LB con 50 μg/ml de kanamicina y cultivarlas como precultivos a 37 °C durante 16 h con agitación a 170 rpm.
4. Inocular 2 ml de las células de precultivo anteriores en 200 ml de caldo LB que contenga 50 μg/ml de kanamicina en un matraz de 1 L. Incubar el matraz de cultivo inoculado a 37 °C durante 2 horas agitando a 170 rpm hasta que la absorbancia a 600 nm alcance aproximadamente 0,4-0,5 detectada por un espectrofotómetro ultravioleta-visible (UV/VIS).
5. Agregue 80 μl de isopropilo 1 M β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el cultivo anterior a una concentración final de 0,4 mM para inducir la expresión de HP-NAP. Incube el cultivo durante 3 horas hasta que la absorbancia a 600 nm alcance aproximadamente 1,6-1,7.
6. Centrifugar las células a 6.000 x g a 4 °C durante 15 min para eliminar el sobrenadante. Almacene el sedimento celular a -70 °C hasta la purificación.

2. Preparación de la fracción de proteína soluble que contiene HP-NAP

NOTA: Todos los pasos siguientes se llevan a cabo a 4 °C.

1. Vuelva a suspender 50 ml del sedimento celular preparado en el paso 1.6 del Protocolo en 20 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM de NaCl que contenga 0,13 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,03 mM de N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK) y 0,03 mM de N-tosil-L-fenilalaninil-clorometilcetona (TPCK) a 4 °C como se describió anteriormente.
2. Altere las células bacterianas pasando la suspensión bacteriana a través de un homogeneizador de alta presión operado a un rango de 15,000 a 20,000 psi durante 7 veces a 4 ° C.
3. Centrifugar el lisado celular a 30.000 × g a 4 °C durante 1 hora para separar las fracciones de proteínas solubles e insolubles mediante una ultracentrífuga. Transfiera el sobrenadante como fracción de proteína soluble a un vaso de precipitados.
4. Mida la concentración de proteína de la fracción de proteína soluble mediante el método Bradford utilizando un kit comercial con albúmina sérica bovina (BSA) como estándar, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Añadir 177,6 μl de HCl 1 N en 20 ml de la fracción de proteína soluble obtenida del paso 2.3 del Protocolo para ajustar su valor de pH de pH 9,0 a pH 8,0.
6. Agregue 20 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM de NaCl a la solución de proteína anterior para que la concentración final de proteína sea de 0.5 mg / ml.

3. Purificación de HP-NAP recombinante de E. coli mediante cromatografía por lotes en modo negativo con resinas de intercambio iónico DEAE

1. Preparar 15 ml de resinas de dietilaminoetilo (DEAE).
   1. Pesar 0,6 g de polvo seco de resinas DEAE y suspenderlo en 30 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl a temperatura ambiente durante al menos 1 día.
   2. Centrifugar la resina a 10.000 x g a 4 °C durante 1 min.
   3. Retire y deseche el sobrenadante.
   4. Añadir 15 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM.
   5. Repita los pasos del Protocolo 3.1.2 a 3.1.4 cuatro veces más.
   6. Almacene los 15 ml de resina sedimentada (50% de purín en 30 ml de tampón Tris) a 4 °C para su uso posterior.
      NOTA: Todos los pasos siguientes se llevan a cabo a 4 °C.
2. Añadir 45 ml de las proteínas solubles preparadas en el paso 2.6 del Protocolo a 15 ml de la resina y agitar la suspensión/resina con un agitador magnético a 4 °C durante 1 hora.
3. Vierta la suspensión de proteína/resina en una columna de plástico o vidrio equipada con una llave de paso. Deja que la resina se asiente bajo la gravedad.
4. Abra la llave de paso para permitir que la solución de proteína corra a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna esté justo por encima de la resina. Recoja el flujo como la fracción no unida, que contiene el HP-NAP purificado.
5. Agregue 15 ml de Tris-HCl helado de 20 mM, pH 8.0, 50 mM de NaCl en la columna.
6. Abra la llave de paso para permitir que el tampón de lavado pase a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna esté justo por encima de la resina. Recoge el flujo como fracción de lavado.
7. Repita los pasos del Protocolo 3.5 a 3.6 cuatro veces más para recolectar las fracciones de lavado adicionales.

Materiales