Un procedimiento para la purificación de una proteína marcada con polihistidina de Streptococcus mutans

Resumen

Fuente: Murata, T., et al. Purificación de una proteína de alta masa molecular en Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra un procedimiento paso a paso para la purificación de una proteína marcada con polihistidina secretada por Streptococcus mutans.

Protocolo

1. Proteínas concentradas del sobrenadante de cultivo mediante precipitación de sulfato de amonio.
   NOTA: Extraer de cuerpos celulares si una proteína diana es intracelular.
   1. Centrifugar la suspensión de cultivo bacteriano (Streptococcus mutans) durante 20 min a 10.000 x g a 4 °C. Recuperar el sobrenadante de cultivo en un vaso de precipitados de vidrio de 3 L.
   2. Añadir 1.122 g de sulfato de amonio a 2 L del sobrenadante (80% de saturación) agitando vigorosamente utilizando un agitador magnético. Dejar que el precipitado se forme durante 4 h o más a 4 °C con agitación.
      NOTA: La formación de precipitados puede continuar durante la noche.
   3. Centrifugar la solución precipitada con sulfato de amonio a 15.000 x g durante 20 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante.
   4. Recoja el precipitado con una espátula y transfiéralo a un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml. Vuelva a suspender los gránulos en 35 ml de tampón de unión (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 5 mM de imidazol, pH 8,0).
   5. Dializar la suspensión contra 2.500 ml del tampón de unión utilizando un tubo de diálisis de celulosa regenerada, a 4 °C, con agitación. Reemplace la solución de diálisis después de 2 h y continúe la diálisis durante la noche.
   6. Reemplace la solución de diálisis nuevamente. Continúe dializando durante 2 h más.
2. Centrifugar la suspensión dializada a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de membrana utilizando un equipo de filtración por succión. Transfiera el filtrado a un matraz de 75 cm² .
3. Fraccionar la glucosiltransferasa-SI (GTF-SI) marcada con polihistidina de la suspensión filtrada mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC).
   1. Transfiera 2 ml de la suspensión de resina IMAC cargada con Ni (aproximadamente 1 ml de resina) a una columna cromatográfica cuya salida esté instalada en un tubo de silicona. Retire la solución de almacenamiento por el flujo de gravedad.
      CAUTELA: No permita que la resina se seque en todo el IMAC.
   2. Agregue 3 ml de agua destilada en la columna para lavar la resina. Agregue 5 ml del tampón aglutinante para equilibrar la resina.
   3. Corta el flujo con una polla de pellizco Hoffmann. Agregue 5 ml de la suspensión filtrada del paso 2 para hacer la suspensión.
   4. Agregue toda la suspensión a la suspensión filtrada restante. Agitar la mezcla suavemente durante 30 min a 4 °C.
   5. Vuelva a cargar la mezcla en la columna. Retire la suspensión por el flujo de gravedad. Lave la resina IMAC con 20 ml de tampón aglutinante.
      NOTA: Ajuste el caudal a aproximadamente 2 ml/min con una llave de pellizco Hoffmann durante el IMAC posterior.
   6. Eluya el GTF-SI recombinante con 20 ml del tampón de elución (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 500 mM de imidazol, pH 8,0).
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. El eluido debe almacenarse a 4 °C. La resina IMAC se puede reutilizar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Unidad de ultrafiltración centrífuga	Sartorio	VS2032	Reemplazo de tampón y concentración de proteínas
Centrífuga	Kubota	7780II
Columna cromatográfica	Bio-Rad	7321010	Para IMAC
Pinza de membrana de diálisis	Marca Fisher	21-153-100
Tubos de diálisis	Como uno solo	2-316-06
Imidazol	Wako	095-00015	Tampón de unión y preparación de tampón de elución
Incubadora	Instrumentos médicos y químicos Nippon	LH-100-RDS	Ajuste de temperatura: 37 °C
Microcentrífuga	Kubota	3740
Cloruro de Sodim	Wako	191-01665	Preparación del tampón de unión y del tampón de elución
Dihidrogenofosfato de sodio dihidratado	Wako	192-02815	Preparación del tampón de unión y del tampón de elución
Hidróxido sódico	Wako	198-13765	Preparación del tampón de unión y del tampón de elución
Sulfato de amonio	Wako	015-06737	Precipitación de sulfato de amonio
Resina con carga de Ni	Bio-Rad	1560133	Para IMAC
Filtro de membrana	Merck Millipore	JGWP04700	0,2 μm de diámetro