Medición de la unión de fármacos al caseum de lesiones tuberculosas mediante el método de diálisis de equilibrio rápido

Resumen

Fuente: Sarathy, J. P. et al. Un ensayo de unión a caseum in vitro que predice la penetración del fármaco en las lesiones tuberculosas. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra un ensayo in vitro para medir la unión del fármaco al caseum de las lesiones tuberculosas mediante diálisis de equilibrio rápido. Describe los pasos para preparar suspensiones de caseum, realizar diálisis y calcular la fracción de fármaco no unido para predecir la penetración del fármaco en caseum.

Protocolo

1. Ensayo de diálisis de equilibrio rápido (RED)

1. Aumentar 6,5 μL de la solución de 500 μM del compuesto de prueba en 643,5 μL del homogeneizado para lograr la concentración final de 5 μM (≤1% de DMSO) y vórtice.
2. Coloque los insertos RED en la placa base. Agregue 200 μL de la matriz enriquecida con fármaco en la cámara donante (anillo rojo) de cada inserto RED y 350 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en cada cámara receptora. Prepare 3 insertos para cada compuesto de prueba (muestras triplicadas). Sellar la placa con una placa adhesiva e incubar a 37 °C en el termomezclador a 200 rpm (1 x g) durante 4 h.
3. Después de la incubación, mezcle suavemente el contenido de las cámaras donante y receptora pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces. Pipetee 20 μL de alícuotas de homogeneizado de las cámaras donantes y agregue 20 μL de PBS limpio en un tubo de 1,5 mL (1:1). Del mismo modo, pipetee 20 μL de alícuotas de muestras de PBS de las cámaras receptoras y agregue 20 μL de homogeneizado limpio (coincidencia de matriz).
   NOTA: La coincidencia de matrices elimina la necesidad de realizar 2 curvas de calibración separadas (en homogeneizado y PBS) para el análisis cuantitativo. El contenido de la cámara donante puede sedimentarse con el tiempo. Mezcle suavemente el contenido pipeteando antes de retirar las alícuotas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa base reutilizable del dispositivo Pierce RED	Fisher Scientific	PI-89811
Insertos para dispositivos Pierce RED, 50/caja	Fisher Scientific	PI-89809
Herramienta de extracción de insertos Pierce RED	Fisher Scientific	89812
Junta de placa adhesiva	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)	Tecnologías de la vida	10010-049
DMSO	Sigma	472301