Microscopía microfluídica de lapso de tiempo para estudiar la persistencia de antibióticos en bacterias

Abstract

Fuente: Oms, T., et al. Análisis poblacional y unicelular de la persistencia de antibióticos en Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)

Este video presenta un protocolo para monitorear células bacterianas individuales que expresan una proteína de unión al ADN marcada con fluorescencia dentro de un sistema microfluídico. Ilustra cómo los antibióticos inhiben la mayoría de las células, mientras que una subpoblación de células persistentes sobrevive al tratamiento y vuelve a crecer después de la eliminación de antibióticos.

Protocol

Imágenes de microscopía microfluídica de lapso de tiempo

NOTA: La siguiente sección describe la preparación de la placa microfluídica, así como el procedimiento de adquisición y análisis de imágenes de lapso de tiempo. El objetivo de este experimento es observar y analizar el fenotipo de persistencia tras el tratamiento con antibióticos a nivel unicelular. Los datos recopilados durante este experimento se pueden utilizar para generar una amplia gama de resultados según la pregunta abordada y / o los reporteros fluorescentes utilizados durante el experimento. En el experimento descrito aquí, se llevó a cabo un análisis cuantitativo de la longitud celular y la fluorescencia de HU-mCherry, que refleja la organización nucleoide en células persistentes y no persistentes.

1. Cultivo celular bacteriano para microscopía microfluídica de lapso de tiempo
   1. Inocular 5 mL de glicerol medio (ácido propanosulfónico 3-[N-morfolino] (MOPS) al 0,4%, suplementado con un antibiótico selectivo si es necesario) con una colonia aislada en un tubo de vidrio (≥25 mL), y colocar el tubo en una incubadora agitadora a 37 °C y 180 rpm durante la noche (entre 15 h y 19 h).
   2. Al día siguiente, mida el OD₆₀₀ nm y diluya el cultivo en medio fresco ajustado a temperatura (37 °C, glicerol MOPS 0,4%) en un tubo de vidrio hasta un OD final de₆₀₀ nm de ~0,001. Deje que el cultivo crezca durante la noche (entre 15 h y 19 h) en una incubadora agitadora a 37 °C y 180 rpm para obtener un cultivo temprano en fase exponencial al día siguiente.
2. Preparación de la placa microfluídica y de la microscopía time-lapse
   NOTA: Los experimentos microfluídicos se pueden realizar en dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente (como se describe aquí) o en sistemas microfluídicos producidos internamente.
   1. Retire la solución de conservación (si está presente) de cada pocillo de la placa microfluídica y reemplácela con un medio de cultivo nuevo.
      NOTA: Si la placa microfluídica contiene un pozo de salida de desechos, la solución de conservación del pozo de salida debe eliminarse pero no reemplazarse por el medio.
   2. Selle la placa microfluídica con el sistema de colector haciendo clic en el botón Sellar o mediante el software microfluídico (primero seleccione Herramienta, seguido de Placa de sellado).
      NOTA: Para sellar la placa, se debe aplicar una presión uniforme a la placa y al colector apretando manualmente la placa contra el colector. Si se realiza correctamente, la nota "sellado" debería aparecer en la interfaz ONIX2. Es importante no aplicar ninguna presión a la corredera de vidrio para evitar cualquier riesgo potencial de romper el colector.
   3. Una vez sellado, realice una primera secuencia de cebado (haga clic en Ejecutar secuencia de cebado líquido en la interfaz del software microfluídico).
      NOTA: La secuencia de cebado líquido de ejecución corresponde a 5 min de perfusión a 6,9 kPa para los pocillos 1-5, seguidos de 5 min de perfusión a 6,9 kPa para el pozo 8 y una ronda final de perfusión para el pozo 6 durante 5 min a 6,9 kPa. La secuencia de cebado líquido de ejecución permite la eliminación de la solución de conservación que aún pueda estar presente en los canales que conectan los diferentes pocillos.
   4. Incube la placa en un gabinete controlado termostáticamente del microscopio a la temperatura deseada (aquí, 37 ° C) durante un mínimo de 2 h antes del inicio de la imagen de microscopía.
   5. Inicie una segunda secuencia de cebado líquido antes de comenzar el experimento.
   6. Selle la placa microfluídica haciendo clic en Sellar en la interfaz del software microfluídico. Reemplace el medio en el pozo 1 y el pozo 2 con 200 μL de medio fresco, en el pozo 3 con 200 μL de medio fresco que contenga el antibiótico [aquí, ofloxacina (OFX) a 5 μg·mL⁻¹), en el pozo 4 y el pocillo 5 con 200 μL de medio fresco, en el pozo 6 con 200 μL de medio fresco, y en el pozo 8 con 200 μL de la muestra de cultivo (del paso 1.2) diluida a un DO_{de 600} nm de 0,01 en el medio fresco.
   7. Selle la placa microfluídica como se describe en el paso 2.2 y colóquela en el objetivo del microscopio dentro de la cabina del microscopio.
      NOTA: Asegúrese de colocar una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio antes de colocar la placa microfluídica.
   8. En el software microfluídico, haga clic en Carga de celdas para permitir la carga de celdas en la placa microfluídica.
      NOTA: El paso de carga celular comprende 15 s de perfusión a 13,8 kPa para el pozo 8, seguido de 15 s de perfusión a 27,6 kPa para el pozo 6 y el pozo 8, y una ronda final de perfusión para el pozo 6 durante 30 s a 6,9 kPa. La densidad de las células en la placa microfluídica es fundamental para el experimento. La primera parte de este protocolo microfluídico consiste en cultivar bacterias durante 6 h en un medio fresco antes del tratamiento antibiótico. Después de 6 h de crecimiento, la densidad celular debe ser suficiente para detectar las células persistentes raras (en las condiciones utilizadas en este estudio, las células persistentes se generan a una frecuencia de ^10-4). Si la densidad celular es demasiado alta, es difícil distinguir las células individuales, lo que impide un análisis preciso de una sola célula. Como la tasa de crecimiento depende directamente del medio, se debe evaluar la densidad de células en los campos de microscopía antes de iniciar el experimento.
   9. Establezca un enfoque óptimo utilizando el modo de luz transmitida y seleccione varias regiones de interés (ROI) donde se observe un número de celda apropiado (hasta 300 celdas por campo).
      NOTA: Seleccione al menos 40 ROI para asegurarse de que se generen imágenes de las células persistentes raras.
   10. En el software microfluídico, haga clic en Crear un protocolo. Programe la inyección de medio fresco a 6,9 kPa durante 6 h (pocillo 1-2), seguida de la inyección del medio que contiene el antibiótico a 6,9 kPa durante 6 h (pozo 3) y, finalmente, la inyección de medio fresco a 6,9 kPa durante 20 h (pocillos 4-5).
       NOTA: Un cultivo bacteriano diluido a un DE₆₀₀ nm de 0,01 permite que las bacterias crezcan en la cámara microfluídica durante 6 h, asegurando que las células estén en la fase de crecimiento exponencial. Dependiendo del número de células introducidas en el dispositivo microfluídico durante el paso de carga (ver paso 2.8), la duración de la fase de crecimiento se puede adaptar para obtener hasta 300 células por ROI. Como la persistencia es un fenómeno raro, aumentar el número de células por ROI mejora la posibilidad de observar células persistentes. Sin embargo, el número de celdas no debe exceder las 300 celdas por ROI, ya que esto hace que el análisis de una sola célula sea tedioso.
   11. Realice imágenes de microscopía en modo de lapso de tiempo con un fotograma cada 15 minutos utilizando luz transmitida y la fuente de luz de excitación para el reportero fluorescente. Aquí, se utilizó una fuente de luz de excitación de 560 nm para la señal mCherry (LED de 580 nm al 10% de potencia con filtro 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] y exposición de 100 ms para mCherry). Se utilizó el software Zen3.2 compatible con Zeiss para la obtención de imágenes celulares.
3. Análisis de imágenes
   NOTA: La apertura y visualización de las imágenes de microscopía se realiza con el software de código abierto ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/). El análisis cuantitativo de imágenes se realiza utilizando el software de código abierto ImageJ/Fiji y el complemento gratuito MicrobeJ (https://microbej.com). En este protocolo, se utilizó la versión MicrobeJ 5.13I(14).
   1. Abra el software ImageJ/Fiji en el equipo y arrastre las imágenes de microscopía de lapso de tiempo de hyperstack a la barra de carga de Fiji. Utilice Imagen > Color > Hacer compuesto para fusionar los diferentes canales del hyperstack. Si los canales del experimento de lapso de tiempo no se corresponden con el color deseado (por ejemplo, el contraste de fase se muestra en rojo en lugar de gris), use Imagen > Color > Organizar canales para aplicar el color apropiado a los canales.
   2. Abra el complemento MicrobeJ y detecte las células bacterianas utilizando la interfaz de edición manual. Elimine las celdas detectadas automáticamente y delinee manualmente las celdas persistentes de interés cuadro por cuadro.
      NOTA: Se pueden usar diferentes configuraciones para detectar automáticamente celdas individuales. Aquí se utilizó la detección manual ya que las células persistentes analizadas forman filamentos largos, que rara vez se detectan correctamente mediante la detección automática.
   3. Después de la detección, utilice el icono Resultado en la interfaz de edición manual de MicrobeJ para generar una tabla ResultJ. Guarde el archivo ResultJ y utilícelo para obtener información sobre diferentes parámetros de interés en el análisis de una sola celda. En este protocolo, se exportó la fluorescencia media de la intensidad de HU-mCherry, la longitud celular y el área celular de las células individuales.

Materials