Cribado de moduladores cíclicos de di-GMP utilizando bacterias que expresan una proteína indicadora fluorescente

Abstract

Fuente: Rugjee, K. N., et al. Establecimiento de una configuración de alto rendimiento para el cribado de moléculas pequeñas que modulan la señalización de c-di-GMP en Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra la detección de moduladores cíclicos de di-GMP utilizando bacterias modificadas genéticamente que expresan proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de un promotor sensible a c-di-GMP. La fluorescencia se mide en una placa de pocillos múltiples que contiene diferentes compuestos de prueba. Los compuestos que inhiben la producción de c-di-GMP conducen a una fluorescencia reducida. Luego, los datos se analizan para identificar posibles moduladores de la señalización de c-di-GMP en bacterias.

Protocol

1. Generación de proteína fluorescente verde (GFP) marcada con di-GMP cíclico (c-di-GMP) cepa reportera de Pseudomonas aeruginosa

1. Inocular 5 ml de medio de caldo de lisogenia (LB) con una sola colonia de P. aeruginosa e incubar durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm.
2. Transfiera 2 ml del cultivo durante la noche a 200 ml de medio LB fresco en un matraz de 1 L e incube a 37 °C agitando a 200 rpm.
3. Monitorizar la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) cada 30 min tomando una muestra de 1 ml del matraz y examinándola con un espectrofotómetro.
4. Cuando el OD₆₀₀ alcance entre 0,3 y 0,5, coloque 40 ml del cultivo en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml.
5. Peletizar las células centrifugando a 8.000 rpm durante 10 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 40 ml de solución de sacarosa estéril y helada a 300 mM.
6. Granular las células por segunda vez centrifugando como se describe en el paso 1.5 y volver a suspender en 20 ml de solución de sacarosa estéril helada a 300 mM.
7. Granular las células por última vez centrifugando como se describe en el paso 1.5 y volver a suspender en 400 μl de solución de sacarosa estéril helada a 300 mM.
   Nota: La densidad celular en este punto debe ser de aproximadamente 1 x 10¹¹ unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml).
8. Enfríe las celdas en hielo durante 30 minutos, después de lo cual estarán listas para la electroporación.
9. Añadir 1 μl de una solución plásmida de 0,2 μg/μl pCdrA::gfp^C a 40 μl de células electrocompetentes de P. aeruginosa preparadas anteriormente en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que haya sido preenfriado en hielo. Mezcle la suspensión y transfiérala a una cubeta de electroporación preenfriada de 2 mm con espacio entre electrodos.
10. Elimine la humedad del exterior de la cubeta con papel de seda y colóquela en la cámara de muestras del electroporador. Pulso con un voltaje de 2,5 kV, capacitancia de 25 μF y resistencia de 200 Ω.
11. Retire la cubeta y agregue 1 ml de LB medio. A continuación, transfiera las células a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml e incube durante 2 horas a 37 °C agitando a 200 rpm.
12. Extienda 10 μl, 50 μl y 100 μl de alícuotas del cultivo en placas estériles de agar LB suplementadas con ampicilina (a una concentración de 100 μg/ml) e incube las placas a 37 °C durante la noche.
13. Confirme la expresión de GFP (excitación a 485 nm, emisión a 520 nm) examinando la placa bajo un microscopio de fluorescencia con un canal GFP estándar y elija una sola colonia para inocular 5 mL LB. Incube durante la noche como se describe en el paso 1.1. Mezclar 0,5 ml del cultivo nocturno con 0,5 ml de glicerol al 50% en un tubo con tapa de rosca de 2 ml y almacenar a -80 °C.

2. Preparación del cultivo iniciador para la inoculación

1. Dos días antes del cribado, coloque la cepa de P. aeruginosa (que contiene el plásmido pCdrA::gfp^C ) de la cepa de -80 °C en una placa de agar LB (suplementada con ampicilina a una concentración de 100 μg/ml) esparciendo suavemente las bacterias sobre la placa utilizando un asa de inoculación estéril. Incubar la placa durante la noche a 37 °C.
2. La noche anterior al cribado, inocular una sola colonia de P. aeruginosa de la placa en 10 ml de medio LB (suplementado con ampicilina a una concentración de 100 μg/ml) en un tubo e incubar el precultivo durante la noche a 37 °C agitando a 200 rpm.
3. El día de la pantalla, prepare un subcultivo del precultivo durante la noche diluyéndolo primero con medio LB fresco hasta un OD₆₀₀ de 1,0 y luego diluyéndolo aún más con LB al 5% hasta un OD₆₀₀ de 0,04 (proporción 1:25).
   Nota: El volumen total del medio inoculado depende del número de placas que se van a probar. El LB al 5% se produce diluyendo el LB al 100% con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración requerida. Es importante destacar que el medio (5% LB) permite la activación constitutiva de pCdrA::gfp^C en P. aeruginosa.
4. Agregue una barra agitadora magnética estéril en el recipiente y agite el cultivo a una velocidad mínima en un agitador magnético durante 30 minutos a temperatura ambiente, lo que permite que las bacterias se aclimaten al medio antes de dispensarlas en placas de 384 pocillos.

3. Inoculación e incubación de las placas de 384 pocillos que contienen moléculas pequeñas

Nota: La esterilidad y las buenas técnicas asépticas son primordiales para los siguientes pasos.

1. Para preparar el control positivo (inhibición del 100%), agregue 20 μl de sulfato de tobramicina (25 mg / ml) a 10 ml (adecuado para hasta 12 placas) del subcultivo preparado en el Paso 2.3 y mezcle suavemente. Pipetear 40 μl del cultivo de control positivo en los pocillos A23-P23 (Figura 1).
2. Para preparar el control negativo (inhibición del 0%), agregue 30 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 ml (adecuado para hasta 12 placas) del subcultivo preparado en el Paso 2.3 y mezcle suavemente. Pipetear 40 μl del cultivo de control negativo en los pocillos A24-P24 (Figura 1).
3. Para cada una de las placas estampadas con las moléculas pequeñas, inocular un volumen de 40 μl de los cultivos diluidos durante la noche (descritos en el Paso 2.3) en los pocillos A1-P22 (Figura 1).
   Nota: Esto se puede lograr utilizando un robot manipulador de líquidos. Debido a las propiedades heterogéneas de los cultivos bacterianos, es importante mantener una agitación continua y moderada para mantener las bacterias distribuidas de manera consistente en el medio mientras se dispensa. Para hacer esto, siga agitando magnéticamente el cultivo aclimatado del paso 2.4 durante la dispensación.
4. Selle las placas con un sello de cubierta permeable al aire e incube durante 6 horas a 37 °C.
   Nota: El sello permeable al aire es fundamental para mantener condiciones invariables en los 384 pozos y para eludir el posible desarrollo de gradientes de oxígeno en la placa.

4. Medición del crecimiento (OD600) y del nivel intracelular de c-di-GMP (GFP)

1. Aproximadamente 30 minutos antes de la medición espectrofotométrica, precaliente el lector de placas a 37 °C para evitar la condensación.
2. Retire suavemente el sello de la cubierta permeable al aire antes de leer. Mida la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm con un ajuste de 10 destellos por pocillo y un tiempo de estabilización de 0,2 segundos.
3. Antes de medir la fluorescencia, realice un ajuste automático de ganancia y focal basado en el pocillo A24 (control negativo) y establezca el valor objetivo de ganancia en 75% (Figura 1).
   1. Desde el software de control del lector de placas, haga clic en iniciar medición y haga clic en la pestaña ''Ajuste de enfoque y ganancia/ID de placa''.
   2. Seleccione ''Ajuste de enfoque'' y ''Canal A'' a la derecha de la ventana.
   3. Seleccione ''Ajuste de ganancia'' y ''Pozo seleccionado'', y escriba ''75'' como ''Valor objetivo''. Finalmente, elija bien A24 en el diseño de la placa antes de hacer clic en ''Iniciar ajuste''. Una vez realizado el ajuste, haga clic en ''Iniciar medición''.
   4. Mida la fluorescencia del reportero GFP a un máximo de excitación/emisión de 485/520 nm con un ajuste de 10 destellos por pocillo y un tiempo de estabilización de 0,2 segundos.
4. Recopile datos de todas las placas examinadas.
   Nota: Las lecturas de datos se guardan automáticamente como predeterminadas por el software de control del lector de placas.
   1. Vea las lecturas haciendo clic en el icono "Marte" dentro del software de control para abrir el paquete de análisis estadístico.
   2. Recupere datos haciendo "doble clic" en el número de placa de interés para acceder a los datos para su análisis.

Results

Figura 1. Un mapa de placas de 384 pocillos utilizado para el ensayo de cribado de moléculas pequeñas. Los compuestos de la biblioteca (azul claro) se alícuotan en los pocillos A1-P22. El "control positivo" (rojo), que consiste en una concent...

Materials