Una técnica para preparar un cultivo bacteriano monoclonal

Resumen

Fuente: Lin, P., et al. Sintetización de microcápsulas de tungstato de sodio y molibdato de sodio mediante excreción mineral bacteriana. J. Vis. Exp. (2018).

Este video demuestra la preparación de un cultivo bacteriano monoclonal para la producción de minerales a través de la dilución en serie y el aislamiento de colonias en una placa de agar. Al agitar la placa con perlas de vidrio, las células individuales se separan espacialmente para formar colonias genéticamente uniformes, que luego se transfieren a medios líquidos para su crecimiento. Se selecciona el cultivo con mayor turbidez, indicando la población monoclonal más densa y el mayor potencial de producción mineral.

Protocolo

1. Preparación de perlas de vidrio

1. Coloque 100 perlas de vidrio de 3 mm de diámetro en un frasco de laboratorio de 100 ml y luego tápelo herméticamente.
2. Autoclave el contenido a 120 °C durante 10 min.
3. Deje que la botella se enfríe a temperatura ambiente, luego colóquela en el gabinete de bioseguridad.

2. Preparación del caldo de lisogenia (LB)

1. Disuelva 8 g de polvo de caldo LB-Lennox en un frasco de laboratorio de 500 ml con 400 ml de agua.
2. Revuelva el contenido con una barra de agitación magnética de politetrafluoroetileno (PTFE) durante 20 minutos y luego tápelo herméticamente.
3. Autoclave el contenido a 120 °C durante 10 min.
4. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y colóquela en el gabinete de bioseguridad.
5. Con una pipeta, alícuota el caldo en ocho tubos de centrífuga de 15 ml (12,5 ml cada uno) en la cabina de bioseguridad.
6. Alícuota el caldo restante en tres frascos de laboratorio de 100 ml en la cabina de bioseguridad (100 ml cada uno). Tape bien las tres botellas. Guárdelos en el gabinete de bioseguridad.

3. Cultivo de algas Shewanella

1. Utilice la cepa criopreservada ultracongelada.
2. En el gabinete de bioseguridad, saque 1 ml del material congelado del tubo congelado con una espátula de acero inoxidable y colóquelo en un tubo de centrífuga preparado en el paso 3.5.
3. Incubar los cultivos durante 24 h en una incubadora a 37 °C.

4. Preparación de placas de Petri LB-Lennox (caldo con agar)

1. Disuelva dos tabletas de LB-Lennox (caldo con agar) en un frasco de laboratorio de 100 ml con 100 ml de agua.
2. Revuelva el contenido con una barra de agitación magnética de PTFE durante 20 minutos y luego tápelo herméticamente.
3. Autoclave el contenido a 120 °C durante 10 min.
4. En el gabinete de bioseguridad, alícuota a mano 100 ml de solución en 4 placas de Petri, asegurándose de que cada una reciba ~ 25 ml. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente.

5. Preparación de bacterias monoclonales

1. En el gabinete de bioseguridad, etiquete las tres botellas preparadas en los pasos 2.6, #1, #2 y #3, respectivamente.
2. Pipetee 0,1 ml de la suspensión bacteriana resultante en el paso 3.3 en el frasco #1. Tape la botella y gírela con la mano durante 1 minuto para obtener una solución homogénea.
3. Pipetee 0,1 ml del líquido bacteriano resultante en el paso 5.2 en el frasco #2. Tape la botella y gírela con la mano durante 1 minuto para obtener una solución homogénea.
4. Pipetee 0,1 ml del líquido bacteriano resultante en el paso 5.3 en el frasco #3. Tape la botella y agítela a mano durante 1 minuto para obtener una solución homogénea.
5. Pipetear el líquido en la botella #3 en las 4 placas de Petri preparadas en el paso 4.4, utilizando un volumen de 0,02 ml cada una.
6. Coloque las cuentas de vidrio preparadas en el paso 1.3 en las 4 placas de Petri utilizadas, 4 cuentas en cada plato.
7. Cierra las tapas de las placas de Petri y agítalas a mano durante 1 min.
8. Dar la vuelta a las placas de Petri e incubar en una incubadora a 37 °C durante 24 h.

6. Multiplicación de bacterias monoclonales

1. Busque 7 tubos preparados en el paso 2.5.
2. Elija las bacterias monoclonales resultantes de las 4 placas de Petri preparadas en el paso 5.8 con una espátula de acero inoxidable y colóquelas en 7 tubos por separado.
3. Deje los 7 tubos en una incubadora a 37 °C durante 24 h.
4. Elija el que tenga la mayor dispersión de luz utilizando el método colorimétrico visual.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
LB (caldo Lennox) con comprimidos de agar	Sigma-Aldrich	L7075	1 tableta para 50 ml de caldo con agar
LB (caldo Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) polvo 1 kg
Dextrosa anhidra	Reactivo Nihon Shiyaku	PL 78695	glucosa
Tubo centrífugo de 50 ml	Halcón	14-432-22
Tubo centrífugo de 15 ml	Halcón	14-959-53A
Frasco de laboratorio 100 mL	Durán	21 801 24 5
Frasco de laboratorio 500 mL	Durán	21 801 44 5
Espátula de acero inoxidable	Chemglass	CG-1981-10
Barras de agitación desechables de PTFE	Pescador	S68066
Placas de Petri de plástico	Pescador	S33580A
Incubadora	Hecho por el cliente	Hecho a medida	calentar a 40 °C o enfriar a 18 °C con tiempo de corol
Cabina de bioseguridad	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Todos los procesos relacionados con las bacterias se realizan aquí
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Ciudad de Taipei, Taiwán, República de China	TM-329	calentar a 120 °C durante 10 min