Síntesis de microcápsulas de óxido metálico utilizando bacterias reductoras de metales

Resumen

Fuente: Lin, P., et al. Sintetización de microcápsulas de tungstato de sodio y molibdato de sodio mediante excreción mineral bacteriana. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demuestra el procedimiento para sintetizar microcápsulas rígidas de óxido metálico mediante el cultivo de bacterias reductoras de metales con iones metálicos, seguido de una purificación secuencial mediante sonicación, centrifugación y lavado con etanol.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Use guantes de látex, anteojos protectores y una bata de laboratorio para realizar el experimento. Siempre que use el gabinete de bioseguridad, encienda el ventilador del gabinete y mantenga la puerta del gabinete medio cerrada.

1. Preparación de perlas de vidrio

1. Coloque 100 perlas de vidrio de 3 mm de diámetro en un frasco de laboratorio de 100 ml y luego tápelo herméticamente.
2. Autoclave el contenido a 120 °C durante 10 min.
3. Deje que la botella se enfríe a temperatura ambiente, luego colóquela en el gabinete de bioseguridad.

2. Preparación del caldo de lisogenia (LB)

1. Disuelva 8 g de polvo de caldo LB-Lennox en un frasco de laboratorio de 500 ml con 400 ml de agua.
2. Revuelva el contenido con una barra de agitación magnética de PTFE (politetrafluoroetileno) durante 20 minutos y luego tápelo herméticamente.
3. Autoclave el contenido a 120 °C durante 10 min.
4. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y colóquela en el gabinete de bioseguridad.
5. Con una pipeta, alícuota el caldo en ocho tubos de centrífuga de 15 ml (12,5 ml cada uno) en la cabina de bioseguridad.
6. Alícuota el caldo restante en tres frascos de laboratorio de 100 ml (100 ml cada uno) en el gabinete de bioseguridad. Tape bien las tres botellas y guárdelas en el gabinete de bioseguridad.

3. Cultivo de algas Shewanella

1. Utilice la cepa criopreservada ultracongelada.
2. En el gabinete de bioseguridad, saque 1 ml del material congelado del tubo congelado con una espátula de acero inoxidable y colóquelo en un tubo de centrífuga preparado en el paso 3.5.
3. Incubar los cultivos durante 24 h en una incubadora a 37 °C.

4. Preparación de placas de Petri LB-Lennox (caldo con agar)

1. Disuelva dos tabletas de LB-Lennox (caldo con agar) en un frasco de laboratorio de 100 ml con 100 ml de agua.
2. Revuelva el contenido con una barra de agitación magnética de PTFE durante 20 minutos y luego tápelo herméticamente.
3. Autoclave el contenido a 120 °C durante 10 min.
4. En el gabinete de bioseguridad, alícuotas a mano 100 ml de solución en 4 placas de Petri, asegurándose de que cada una reciba ~ 25 ml. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente.

5. Preparación de bacterias monoclonales

1. En el gabinete de bioseguridad, etiquete las tres botellas preparadas en los pasos 2.6, #1, #2 y #3, respectivamente.
2. Pipetee 0,1 ml de la suspensión bacteriana resultante en el paso 3.3 en el frasco #1. Tape la botella y gírela con la mano durante 1 minuto para obtener una solución homogénea.
3. Pipetee 0,1 ml del líquido bacteriano resultante en el paso 5.2 en el frasco #2. Tape la botella y gírela con la mano durante 1 minuto para obtener una solución homogénea.
4. Pipetee 0,1 ml del líquido bacteriano resultante en el paso 5.3 en el frasco #3. Tape la botella y agítela a mano durante 1 minuto para obtener una solución homogénea.
5. Pipetear el líquido en la botella #3 en las 4 placas de Petri preparadas en el paso 4.4, utilizando un volumen de 0,02 ml cada una.
6. Coloque las cuentas de vidrio preparadas en el paso 1.3 en las 4 placas de Petri utilizadas, 4 cuentas en cada plato.
7. Cierra las tapas de las placas de Petri y agítalas a mano durante 1 min.
8. Dar la vuelta a las placas de Petri e incubar en una incubadora a 37 °C durante 24 h.

6. Multiplicación de bacterias monoclonales

1. Busque 7 tubos preparados en el paso 2.5.
2. Elija las bacterias monoclonales resultantes de las 4 placas de Petri preparadas en el paso 5.8 con una espátula de acero inoxidable y colóquelas en 7 tubos por separado.
3. Deje los 7 tubos en una incubadora a 37 °C durante 24 h.
4. Elija el que tenga la mayor dispersión de luz utilizando el método colorimétrico visual.

7. Preparación del caldo LB-Lennox con glucosa y sal

1. Ponga 10 g de caldo LB-Lennox, 10 g de NaCl y 10 g de glucosa en un frasco de laboratorio de 500 ml. Agregue agua hasta que el volumen alcance los 450 ml.
2. Revuelva el contenido con una barra de agitación magnética de PTFE durante 20 min.
3. Autoclave el contenido a 120 °C durante 10 min.

8. Preparación de tungstato de sodio

1. Ponga 16,5 g de tungstato sódico Na₂WO_{4,2H 2}O en un frasco de laboratorio de 100 ml con una espátula de acero inoxidable. Agregue agua hasta que el volumen alcance los 50 ml.
2. Revuelva el contenido con una barra de agitación magnética de PTFE durante 20 min.
3. Autoclave el contenido a 120 °C durante 10 min.
4. En la cabina de bioseguridad, obtenga filtrado a través de un filtro de fibra de vidrio al vacío con poros de 1 μm.

9. Preparación de LB con glucosa, sal y tungstato de sodio

1. En la cabina de bioseguridad, vierta el filtrado obtenido en el paso 8.4 a mano en la solución con glucosa y sal preparada en el paso 7.3.
2. En la cabina de bioseguridad, alícuotas con una pipeta la solución resultante de 500 ml en el paso 9.1 en tubos de centrífuga de 10 x 50 ml.

10. Cultivo de bacterias

1. En el gabinete de bioseguridad, busque el líquido preparado en el paso 6.4 y alícuelo con una pipeta en los 10 tubos de ensayo preparados en el paso 9.2, y cada tubo recibirá 0,05 ml.
2. Incubar los 10 tubos en una incubadora a 37 °C durante 120 h.

11. Cosecha de minerales BME

1. Ultrasonique cada uno de los 10 tubos en el paso 9.2 a 20 KHz con 150 W durante 1 h.
2. Centrifugar los tubos a 2.025 x g durante 1 h.
3. Retire el líquido transparente de los tubos con una pipeta, agregue agua y luego repita los pasos 11.1 y 11.2 una vez más.
4. Retire el líquido transparente de los tubos con una pipeta, agregue alcohol y luego hágalos ultrasonicar a 20 KHz con 150 W durante 1 h.
5. Centrifugar los tubos a 2.025 x g durante 1 h.
6. Repita los pasos 11.4 y 11.5 una vez más
7. Cosecha minerales BME eliminando el líquido transparente de los tubos con una pipeta; Después, tapar inmediatamente los tubos sin realizar ningún proceso de secado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo LB (Lennox) con tabletas de agar	Sigma-Aldrich	L7075	1 tableta para 50 ml de caldo con agar
Caldo LB (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) polvo 1 kg
Dextrosa anhidra	Reactivo Nihon Shiyaku	PL 78695	glucosa
Tungstato de sodio	Reactivo Nihon Shiyaku	PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
Cloruro de sodio	Reactivo Nihon Shiyaku	PL 68131	NaCl
Etanol 99,5%	Acros orgánicos	AC615090040	CH3CH2OH
Agua	Hecho en nuestra universidad		agua desionizada
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Ciudad de Taipei, Taiwán, República de China	TM-329	calentar a 120 °C durante 10 min
Centrífuga	Sistema de laboratorio Digit System, ciudad de New Taipei, Taiwán, República de China	DSC302SD	centrífuga a 2025 x g
Frigorífico de -80 °C	Panasonic	MDF-U3386S	Úselo para congelar la cepa de criopreservación.
Homogeneizador ultrasónico Sonicador Procesador Disruptor celular	Lenox	UPS-150	frecuencia 20 KHz potencia 150 W
Incubadora	Hecho por el cliente	Hecho a medida	calentar a 40 °C o enfriar a 18 °C con tiempo de corol
Baños de agitación recíproca	Kingtech Scientific Co., Ltd	WBS-L
Placa calefactora de agitación digital	Corning	#6797-620D	uso con barra de agitación magnética de PTFE
Cabina de bioseguridad	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Todos los procesos relacionados con las bacterias se realizan aquí
Tubo centrífugo de 50 ml	Halcón	14-432-22
Tubo centrífugo de 15 ml	Halcón	14-959-53A
Frasco de laboratorio 100 mL	Durán	21 801 24 5
Frasco de laboratorio 500 mL	Durán	21 801 44 5
Espátula de acero inoxidable	Chemglass	CG-1981-10
Barras de agitación desechables de PTFE	Pescador	S68066
Placas de Petri de plástico	Pescador	S33580A
Alga Shewanella	Cortesía del autor #3	Cortesía del autor #3