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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.
1. Diseño experimental
- Iniciar el tratamiento de los animales por sonda oral, después de 2 días de aclimatación. Use una jeringa con la aguja de sonda oral. Tratar 16 ratas con suspensión de Bacillus subtilis BSB3 (1 ml por rata) dos veces al día durante dos días (grupo B. subtilis). Tratar 16 ratas con solución salina tamponada con fosfato, PBS (1 ml por rata), dos veces al día durante dos días (grupo PBS) (Figura 1).
- Después del tratamiento, subdivida cada grupo (8 ratas por grupo): Grupo 1-control (PBS / sin estrés), Grupo 2-B. subtilis (B. subtilis / sin estrés), Grupo 3 estrés (PBS / estrés por calor) y Grupo 4- B. subtilis + estrés (B. subtilis / estrés por calor).
- Mida la temperatura rectal de cada rata con un termómetro digital electrónico. Mantenga a las ratas de los grupos 1 y 2 a temperatura ambiente durante 25 min. Coloque a los animales de los grupos 3 y 4 en una cámara climática a 45 °C y 55% de humedad relativa durante 25 min.
- Luego, mida la temperatura rectal de cada rata en todos los grupos con un termómetro digital electrónico. Coloque todos los animales a temperatura ambiente durante 4 horas.
- Anestesiar ratas con isoflurano (2 - 4%) en un frasco de anestesia sellable y observar hasta que las ratas estén profundamente anestesiadas (ausencia de respuesta al pellizco del dedo del pie). Eutanasia a las ratas mediante la decapitación rápida con una guillotina.
- Recoger la sangre del tronco de cada rata (15 - 16 ml) con las pipetas apirogénicas en tubos apirogénicos para obtener suero, e inmediatamente tomar muestras de sangre (7 μl de cada rata) con una pipeta para su examen microscópico.
- Coloque los tubos con la sangre en un refrigerador durante al menos 30 minutos para permitir la coagulación. Centrifugar los tubos a 20 °C, 7.000 x g durante 10 min, y retirar rápidamente el suero con una pipeta. Alícuota del suero obtenido de cada rata en volúmenes de 50 μl y almacenar a -20 °C hasta el ensayo.
2. Procedimiento quirúrgico
- Corta / recorta todo el pelaje del abdomen y el tórax de la parte inferior de la carcasa con tijeras eléctricas. Coloque la carcasa en un gabinete estéril y trate la superficie afeitada de la canal con alcohol al 70%.
- Use un bisturí estéril para crear una incisión en la línea media del abdomen. Extirpe el hígado, los ganglios linfáticos mesentéricos, el bazo y el intestino delgado de cada rata con pinzas estériles.
3. Análisis de la translocación bacteriana
- Coloque cada muestra de hígado, ganglios linfáticos mesentéricos y bazo en tubos estériles previamente pesados y pese. Calcule el peso de la muestra como la diferencia entre el peso de un tubo con una muestra y el peso de un tubo vacío.
- Agregue PBS estéril al tubo para obtener una dilución 1:10 (peso por volumen, p / v) de la muestra y homogeneice cada muestra con un homogeneizador de tejido de vidrio estéril para obtener una suspensión homogénea.
- Realice diluciones seriadas (10-1 a 10-4) de cada muestra en PBS estéril. Coloque 0,1 ml de todas las diluciones de cada tejido en la superficie de las placas de agar MacConkey y 5% de agar sangre y agar Brucella con hemina (0,005 g/L) y vitamina K1 (0,01 g/L).
- Incubar las placas de agar sangre MacConkey y al 5% aeróbicamente y las placas de agar sangre Brucella en condiciones anaeróbicas a 37 oC.
- Cuente las colonias de bacterias aeróbicas después de 24 horas y las colonias de bacterias anaeróbicas después de 48 horas de incubación utilizando un contador de colonias. Exprese los resultados como el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en un gramo de tejido.
