Producción y deposición en aerosol de esporas de Bacillus subtilis

Resumen

Fuente: Fuchs, F. M., et al. Investigación de los efectos perjudiciales de la esterilización con plasma a baja presión en la supervivencia de las esporas de Bacillus subtilis mediante microscopía de células vivas. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra la producción, purificación y deposición a base de aerosoles de esporas de Bacillus subtilis para crear una monocapa uniforme, lo que permite aplicaciones posteriores como el análisis basado en microscopía de la germinación de esporas, la viabilidad o la respuesta al estrés.

Protocolo

1. Producción y purificación de esporas de Bacillus subtilis

1. Para la producción de esporas, transfiera un cultivo nocturno de 5 ml de la cepa respectiva de B. subtilis , suplementado con antibióticos apropiados, a 200 ml de medio líquido de esporulación Schaeffer de doble concentración (por litro 16 g de caldo nutritivo, KCl (cloruro de potasio) 2 g, 0,5 g de MgSO₄*7 H₂O (sulfato de magnesio heptahidratado), 2 ml 1 M Ca(NO₃)₂ (nitrato de calcio), 2 mL 0,1 M MnCl₂ *• 4 H₂O (cloruro de manganeso tetrahidratado), 2 mL 1 mM FeSO₄ (sulfato ferroso), 2 mL 50% (p/v) glucosa18) y cultivarlo con aireación vigorosa a 37 °C durante 72 h o hasta > 95% del cultivo haya esporulado. Se utilizan las esporas de las siguientes cepas: B. subtilis PY79 (tipo salvaje) B. subtilis PY79ΔrecA::neo (deficiente en la proteína de reparación del ADN RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp::cat (RecA fusionada con la proteína fluorescente amarilla [YFP]).
2. Coseche las esporas por centrifugación durante 15 min a 3.000 x g en tubos de 50 ml y purifique las muestras mediante pasos de lavado repetidos (hasta 15 veces) utilizando H₂O destilado estéril y verifique la pureza y el estado de germinación mediante microscopía de contraste de fase. Asegúrese de que las suspensiones de esporas consistan en esporas de fase brillante (> 99%) y estén libres de células vegetativas (bastones), esporas germinadas (apariencia negra / gris) y restos celulares; de lo contrario, se pueden perturbar otros experimentos de microscopía. Lave la muestra hasta alcanzar la pureza deseada.
3. Determine el título de esporas sembrando 50 μL de diluciones seriadas de 10 veces en LB (luria-bertani)-agar (es decir: use una muestra de 30 μL + 270 μL de agua estéril para una dilución de 1:10. Tome 30 μL de la dilución particular a 270 μL H₂O para una dilución 1:100 y así sucesivamente) para calcular las UFC (unidades formadoras de colonias) e incubar las placas a 37 °C durante la noche. Después de la determinación de UFC, ajuste la muestra a 10⁹ esporas por ml concentrando o diluyendo con agua estéril.

2. Preparación de muestras de esporas de Bacillus subtilis depositadas en aerosol

NOTA: La acumulación y superposición de esporas puede provocar efectos de sombreado durante el tratamiento, lo que en última instancia resulta en una cinética de inactivación falsificada. Para minimizar este problema, prepare muestras de esporas mediante una técnica de deposición de aerosoles. Brevemente, controle la boquilla de dos sustancias de alta precisión con un temporizador eléctrico que regula el rendimiento del líquido en concierto con el flujo de gas portador presurizado (aquí N₂). Disperse la muestra líquida inyectada a través de la salida de la boquilla utilizando el flujo de gas nitrógeno.

1. Coloque un portamuestras en forma de portaobjetos microscópicos esterilizados (para la cinética de supervivencia) o cubreobjetos redondos de 25 mm (para el seguimiento fluorescente de los procesos de reparación del ADN/cLSM; microscopía de barrido láser confocal) dentro de la unidad de pulverización de aerosol operada eléctricamente en alineación con la boquilla. La concentración de esporas utilizada debe corresponder a cien veces la concentración final deseada.
2. Transfiera 1 ml del cultivo de esporas a la entrada de fluido de la boquilla e inicie el proceso de pulverización de 0,1 s a una presión de 1,3 bar. La suspensión de esporas rociadas (1 x 10⁷) forma una película delgada en el portaobjetos microscópico que se seca rápidamente en segundos para formar una monocapa de esporas distribuida uniformemente. Almacene los portadores de muestras tratados en un recipiente estéril a temperatura ambiente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Boquilla de dos sustancias (modelo 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, diámetro interior de 0,8 mm
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Conectores de tubo	Festo	N/A	G 1/8
Portaobjetos de vidrio	VWR	48300-026
Cámara de celdas de attofluor	Menzel, Pescador Ref.	3406816	d=25 mm, redondo
Sulfato de magnesio heptahidratado	Sigma Aldrich	13152
Nitrato de calcio	Sigma Aldrich	202967
Cloruro de manganeso tetrahidratado	Sigma Aldrich	244589
Sulfato ferroso	Aplicación química	13446-34-9
Glucosa	Merck	215422
Cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P9541-500G
Caldo nutritivo (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
placa de 96 pocillos	ThermoFisher	243656