Análisis de viabilidad de Microcystis aeruginosa mediante citometría de flujo

Resumen

Fuente: Chapman, I. J., et al., Optimización de la sonda molecular para determinar la mortalidad celular en un organismo fotosintético (Microcystis aeruginosa) mediante citometría de flujo. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra el método para distinguir células vivas y muertas de Microcystis aeruginosa mediante la combinación del etiquetado de sondas fluorescentes con el análisis de citometría de flujo de la autofluorescencia de ficocianina y la señal de la sonda.

Protocolo

1. Optimización de la captación de células de sonda molecular

1. Coseche la mitad del cultivo de M. aeruginosa de una fase exponencial y utilícelo como control "vivo".
   NOTA: Las muestras diluidas de un cultivo de alta densidad directamente a una fase exponencial pueden afectar los resultados de optimización a través del recambio de células muertas en comparación con los cultivos inoculados desde una fase inicial de retraso / inducción.
2. Prepare la otra mitad como un control "muerto" utilizando métodos como etanol al 70%, calentando muestras a 60 ^oC durante 1 hora, paraformaldehído o formaldehído al 4% durante 30 min. Verifique las variaciones en el microambiente de las muestras (p. ej., pH).
   NOTA: El control positivo, muerto por calor y "muerto" en M. aeruginosa se distingue de una muestra "viva" por su disminución de las señales de ficocianina. La inducción de la mortalidad por otros métodos puede no causar el mismo resultado y variará según la especie.
3. Configure muestras mixtas utilizando diferentes proporciones de muestras "vivas" y "muertas" (por ejemplo, 0%, 25%, 50%, 100%).
4. Desagregar la formación de colonias mediante vórtice o sonicación y comprobar el pH.
5. Seleccione un láser de 488 nm junto con detectores que puedan registrar la fluorescencia de las sondas de ácido nucleico verde (canal de fluorescencia 1 o FL1, 530 ± 15 nm) y naranja (canal de fluorescencia 2 o FL2, 585 ± 20 nm) y el láser de 640 nm para registrar señales de ficocianina a través de su respectivo detector.
   NOTA: Cuando se une al ADN, la sonda de ácido nucleico verde tiene una longitud de onda de excitación de fluorescencia aproximada de 504 nm y un máximo de emisión de 523 nm, mientras que la sonda de ácido nucleico naranja tiene una longitud de onda de excitación de 547 nm y un máximo de emisión de 570 nm. Se puede emplear un láser de estado sólido de iones de argón de 488 nm para excitar ambas sondas moleculares, sin embargo, un láser verde (hasta 547 nm) producirá una fluorescencia naranja más alta.
6. Como punto de partida, introduzca la sonda molecular a la concentración recomendada por el fabricante en el cultivo 50% "vivo" y 50% "muerto" e incube en la oscuridad.
7. Seleccione una nueva celda de datos, coloque la muestra debajo del puerto de introducción de muestras (SIP) con umbrales y activadores que reducirán el ruido de fondo (FSC-H o altura de dispersión directa, 80,000).
8. Cree un gráfico de densidad con parámetros FSC-H y SSC-H (altura de dispersión lateral) y tres histogramas. Un histograma que utiliza el canal detector óptico de sonda molecular respectivo (FL1 o 2), uno para detectar emisiones de ficocianina (canal de fluorescencia 4 altura o FL4-H) y el otro, FSC-H, todo a escala logarítmica.
9. Incube las muestras de M. aeruginosa con las sondas de ácido nucleico en la oscuridad durante un máximo de 60 minutos, registrando en células de datos separadas en varios puntos de tiempo (1, 5, 10, 15, 30 y 60 minutos).
   NOTA: Al ajustar parámetros como el pH, consulte con los fabricantes las posibles reacciones de ciertos productos químicos (para las sondas de ácido nucleico probadas, un tampón no puede contener fosfatos o altos niveles de cationes monovalentes o divalentes, ya que se reducirá la unión con el ADN).
10. Aplique una puerta de software para incluir solo el histograma FSC-H (320,000 - 1,500,000) para el tamaño de la célula del organismo objetivo en el histograma del canal de la sonda de fluorescencia respectivo.
    NOTA: Las concentraciones utilizadas en este protocolo fueron 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 y 100 μM, que pueden modificarse aumentando o disminuyendo el volumen de la muestra de M. aeruginosa o la solución madre inicial de las sondas nucleicas.
11. En el canal de la sonda de fluorescencia, aplique otra puerta de software inclusiva al pico más alto del histograma (verde FL1-H, 240,000 - 1,650,000, naranja FL2-H, 30,000 - 165,000) y posteriormente coloque esa fluorescencia positiva de la sonda en el gráfico de densidad.
12. Ejecute los pasos 3.1 a 3.11 con muestras de cultivo 100% "vivas", 100% "muertas" y todas mixtas, ajustando las concentraciones de la sonda molecular (p. ej., x 0.1 a x 10) y/o los niveles de temperatura y pH si es necesario.
13. Compare el número de señales de fluorescencia de sonda molecular positivas con la densidad celular original de células "muertas" (tomadas de la mitad del FSC-H total o de un cultivo 100% "muerto") para encontrar el porcentaje total de células teñidas con las sondas de ácido nucleico.
14. Haga esto para cada período de tiempo dentro de cada concentración para encontrar el protocolo óptimo para el mayor porcentaje de captación de sonda nucleica celular sin producir tinción no específica (use las medias en un análisis de varianza unidireccional, ANOVA o análisis de varianza unidireccional de Kruskal-Wallis si los datos no son paramétricos).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cianobacterias Medio	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Solución concentrada de agua dulce (dilución x50)
Fluido de descontaminación	BD Biociencias	653155	Ejecute durante 2 minutos cuando las salidas sean más de 12 eventos por segundo en rápido o con un caudal de 66 μl/min. Seguido de 2 min de vaina H2O.
Citómetro de flujo	BD Biociencias	por solicitud	BD Accuri C6
SYTOX Verde	Tecnologías de la vida	S7020	Tinción de ácido nucleico: solución de 5 mM en DMSO
SYTOX Naranja	Tecnologías de la vida	S11368	Tinción de ácido nucleico: solución de 5 mM en DMSO