Evaluación de la actividad antimicrobiana de las variantes de nisina mediante un ensayo de difusión de pocillos de agar

Resumen

Fuente: Nickling, J. H., et.al. Péptidos antimicrobianos producidos por la incorporación selectiva de aminoácidos no canónicos a presión. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra un ensayo de difusión de pocillos de agar utilizado para evaluar la actividad antimicrobiana de las variantes de nisina. Muestra cómo Lactococcus lactis que expresa la peptidasa unida a la membrana NisP activa los precursores de nisina producidos en E. coli, lo que da como resultado halos de inhibición del crecimiento. El tamaño de estos halos refleja la bioactividad de cada variante de nisina.

Protocolo

1. Prueba de actividad antimicrobiana

1. Preparación de placas de agar GM17 en condiciones estériles
   1. Preparar un cultivo nocturno de la cepa indicadora L. lactis NZ9000 que lleva el plásmido pNG nisPT a 30 °C en caldo M17 con glucosa al 1% (p/v) (=GM17) y 5 μg/mL de cloranfenicol.
   2. Mida OD₆₀₀, inocule el medio fresco a OD₆₀₀ = 0,1 e incube hasta OD₆₀₀ = 0,4-0,6. Luego coloque el matraz en hielo.
      NOTA: Cada medición de OD₆₀₀ consumirá volumen de cultivo. Tenga en cuenta que para cada placa de agar de ensayo, se necesitará 1 ml de cultivo bacteriano. Si es necesario, amplíe el volumen de cultivo líquido en consecuencia.
   3. Para agar al 1,5%, pesar 4,5 g de agar en una botella de vidrio para medios. Agregue 300 ml de ddH₂O, mezcle y autoclave.
   4. Preparar 2x caldo M17 (dos veces concentrado) en 300 mL ddH₂O y esterilizar en autoclave.
   5. Mezclar 25 ml de caldo 2x M17 que contenga 10 μg/ml de cloranfenicol y 2% de glucosa con 1 ml de precultivo de L. lactis (4% v/v).
   6. Agregue 25 ml de agar fundido al 1,5% (recién esterilizado en autoclave o calentado en microondas).
      NOTA: Antes de esto, deje que la botella se enfríe al tacto (alrededor de 50 ° C). Esto es necesario ya que L. lactis es un organismo mesófilo sensible a las altas temperaturas.
   7. Vierta la solución en una placa de Petri grande. Seque los platos durante 10-15 min.
   8. Esterilice los extremos de una pipeta Pasteur de vidrio a la llama. Espere a que se enfríe, luego use el extremo ancho para crear agujeros en el agar GM17 solidificado.
2. Preparación de muestras
   1. Tomar 1 ml de los cultivos de expresión de E. coli en un tubo de 1,5 ml marcado y centrifugar durante 3 min a 7.000 x g. Aspire el medio restante y vuelva a suspender el sedimento celular en 500 μL de Na-P (tampón de fosfato de sodio de 50 mM, pH 7,4 hecho de fosfato de dihidrógeno de sodio 0,5 M y fosfato de hidrógeno disódico 0,5 M).
   2. Sonicar las muestras en hielo. Sumerja la punta de la sonda sonicadora en la suspensión celular. Ajuste el sonicador al 30 % de amplitud con pulso de 1 s encendido y 5 s apagado durante 3 min.
   3. Centrifugar el lisado celular durante 10 min a 13.000 x g para granular los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción con hielo.
   4. Diluir y normalizar los sobrenadantes del extracto celular a 1 mL OD₆₀₀ = 0,6, en relación con la densidad celular recolectada, con Na-P.
3. Prueba de actividad
   1. Agregue 40 μL de cada muestra normalizada en un orificio de la placa de agar indicadora (Figura 1). Use cloranfenicol a 400 μg/ml como compuesto de control antibacteriano. Utilice el tampón de elución como control negativo. Espere hasta que todas las muestras se difundan en el agar. Incubar la placa durante la noche a 30 °C.
   2. Tome fotografías de las placas de agar con un escáner plano o una cámara digital. Los tamaños de los halos de inhibición del crecimiento se pueden medir a mano o con ImageJ.

Resultados

Figura 1. Ensayo de actividad antimicrobiana de lisados celulares que contienen variantes de nisina producidas a través de SPI con análogos de prolina. Comparación de variantes de nisina con muestras rec...

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