Preparación de medio de esputo artificial para emular la fibrosis quística Esputo pulmonar ex vivo

Resumen

Fuente: Vieira, J., et al. Diseño y desarrollo de un modelo para estudiar el efecto del oxígeno suplementario en el microbioma de las vías respiratorias de la fibrosis quística. J. Vis. Exp. (2021).

Este video demuestra la preparación de un medio de esputo artificial que imita la viscosidad, la composición de nutrientes y el pH del esputo pulmonar de fibrosis quística. El medio resultante proporciona una plataforma fisiológicamente relevante para estudios ex vivo.

Protocolo

1. Preparación del medio de esputo artificial

NOTA: Las cantidades enumeradas aquí son para la producción de 1 L de medio de esputo artificial final y asumen los reactivos específicos enumerados en la Tabla de materiales. Los números deben ajustarse para otros volúmenes o para el uso de diferentes reactivos para garantizar el mismo producto final. Consulte la Tabla 1 para conocer las concentraciones objetivo.

1. Mezcla química de esputo artificial (ASCM)
   NOTA: ASCM constituye el 25% del volumen medio final. Es estable en almacenamiento y se puede preparar a granel o con anticipación. Si se prepara para su uso posterior, esteriliza en autoclave la mezcla química y guárdala de forma segura a temperatura ambiente.
   1. Mezcle las soluciones madre químicas constituyentes.
      1. Preparar 1 M de caldo de NaCl: Añadir 58,44 g de NaCl por litro de agua estéril.
      2. Preparar 1 M de caldo de KCl: Añadir 74,55 g de KCl por litro de agua estéril.
      3. Preparar 1 M de caldo de MgSO₄ : Añadir 246,47 g de MgSO₄·7H₂O por litro de agua estéril, o 120,37 g de MgSO_{anhidro 4} por litro de agua estéril.
      4. Preparar 1 M de caldo de glucosa: Añadir 180,16 g de glucosa por litro de agua estéril.
   2. Esterilice en autoclave las soluciones de stock de productos químicos, así como una botella vacía de 250 ml. Realice los pasos de autoclave a valores estándar de al menos 121 °C y 15 PSI durante 30 min.
   3. Agregue 80,59 ml de agua estéril a la botella vacía de 250 ml.
   4. Agregue 152,30 ml de 1 M de caldo de NaCl a la mezcla.
   5. Agregue 15,8 ml de caldo de 1 M KCl a la mezcla.
   6. Agregue 610 μL de caldo 1 M MgSO₄ a la mezcla.
   7. Agregue 700 μL de caldo de glucosa 1 M a la mezcla.
2. Mezcla artificial de mucina de esputo (ASMM)
   NOTA: ASMM constituye el 50% del volumen medio final. Asegúrese de que se prepare el mismo día que el último lote mediano.
   1. Agregue 450 ml de agua estéril a una botella vacía de 1 l.
   2. Agregue 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x al frasco.
   3. Agregue una barra de agitación magnética desechable a la botella.
   4. Autoclave la botella que contiene PBS y la barra de agitación.
   5. Mide 10 g de mucina en polvo y agrégala al PBS.
   6. Agite la botella vigorosamente para mezclar preliminarmente.
   7. Coloque la botella en una placa caliente con un agitador magnético. Ajuste el fuego a medio-alto, apuntando a 50 ° C y la velocidad de agitación a 1100 rpm. Aumente la velocidad gradualmente para que la barra no salga volando del imán.
      1. Deje calentar y revuelva durante 15 min.
      2. Levante la botella con guantes resistentes al calor. Observe para verificar si el polvo de mucina se asienta fuera de la solución.
      3. Si el polvo de mucina no se disuelve por completo, vuelva a colocar el frasco en el calentador/agitador durante intervalos de 5 minutos hasta que se disuelva por completo.
   8. Deje que la mezcla de mucina se enfríe a temperatura ambiente.
3. Mezcla biológica de esputo artificial (ASBM)
   NOTA: La MAPE es el 25% del volumen medio final. Prepárelo el mismo día que el lote mediano final y, a diferencia de las otras mezclas, no exponga sus componentes al calor.
   1. Descongele el caldo de vitaminas 100x en un refrigerador a 4 ° C o en hielo. ​
      NOTA: Divida previamente el caldo de vitaminas en alícuotas de 10 ml para minimizar el número de ciclos de congelación / descongelación.
   2. Agregue 124,24 ml de agua estéril a la botella vacía de 250 ml esterilizada en autoclave.
   3. Agregue 25,76 ml de caldo de aminoácidos esenciales 50x a la mezcla.
   4. Agregue 80,14 ml de 100 veces el caldo de aminoácidos no esenciales a la mezcla.
   5. Agregue 10 ml de caldo de vitaminas 100x (descongelado) a la mezcla.
   6. Agregue 1 ml de stock de metales traza 1000x a la mezcla.
   7. Agregue 8,33 ml de emulsión de yema de huevo al 30% a la mezcla.
   8. Agregue 400 μL de caldo de ferritina de 10 g/L a la mezcla.
   9. Mezclar bien la solución mediante agitación manual.
4. Medio de esputo artificial (ASM)
   1. Agregue 250 ml de ASCM a la botella de 1 L que contiene ASMM.
   2. Agregue 250 ml de ASBM a la botella mediana.
   3. Valore el medio con tampón MOPS básico (1 M) para alcanzar un pH de 6,3 en un papel de pH de rango estrecho. Antes de la valoración, la mezcla media será demasiado ácida.
   4. Refrigere el medio de esputo artificial resultante a 4 °C hasta que esté listo para la filtración.
   5. Para iniciar el proceso de filtración, transfiera 200 ml de medio de esputo artificial sin filtrar a un sistema de filtración al vacío con un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
   6. Conecte el sistema de filtración a la bomba de vacío, encienda la bomba de vacío, ajústela a 70 mbar y luego coloque la cámara en un agitador orbital agitando a 90 rpm en una cámara frigorífica a 4 °C.
      1. Completar con 150 ml adicionales del medio, ya que se filtra una cantidad apreciable. Se tarda de 1 a 2 días en filtrar 1 L de medio por completo.
      2. Repita con cámaras adicionales hasta que se filtre todo el medio.
         NOTA: Trate de no filtrar más de 350 ml del medio a través del mismo filtro de 0,22 μm, ya que la mucina taponará el filtro con el tiempo.
   7. Refrigere el medio de esputo artificial filtrado a 4 °C hasta que esté listo para su uso. Use ASM dentro de un mes de la preparación para obtener mejores resultados.

Tabla 1: Receta de medio de esputo artificial derivada de la revisión de la literatura. (Columna 1) Reactivos y valores clave en la formulación del medio de esputo artificial. (Columnas 2-7) Comparación de recetas de la literatura existente. (Columnas 8-9).

Columna 1		Columna 2	Columna 3	Columna 4	Columna 5	Columna 6	Columna 7	Columna 8	Columna 9
Valor		Comstock	Kirchner	Sriramulu	Palmer	Flynn	Gallagher	Lai	Fuente
Mucina		2% p/v	0,5% p/v	0,5% p/v	-	1% p/v	2% p/v	1% p/v	Flynn
Cloruro de sodio		85,5 mM	85,5 mM	85,5 mM	66,6 mM	89,8 mM	85,5 mM	152,3 mM	Lapierre
Cloruro de potasio		29,5 mM	29,5 mM	29,5 mM	15,8 mM	-	2,95 mM	15,8 mM	Palmer
Sulfato de magnesio		-	-	-	0,6 mM	1 mM	1 mM	0,61 mM	Palmer
Sulfato de hierro		-	-	-	0,0036 mM	-	-	-	-
Cloruro de amonio		-	-	-	2,3 mM	60 mM	-	-	-
Fosfato monopotásico		-	-	-	2,5 mM	60 mM	-	-	-
Glucosa		-	-	-	3,2 mM	13 mM	40 mM	0,7 mM	Sambeek
Lactato		-	-	-	9 mM	-	-	-	-
Aminoácidos esenciales		14,45 veces	0,25 g/L	0,25 g/L	Por ácido	0,5 veces	0.375x	1,29 veces	Palmer
Aminoácidos no esenciales		28,9 veces	0,25 g/L	0,25 g/L	Por ácido	0,25 veces	0,5 veces	8.01x	Palmer
Vitaminas		-	-	-	-	-	1x	1x	Gallagher
Metales traza		-	-	-	-	1x	1x	1x	Flynn
Yema		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	Kirchner
Ferritina		0,0003 g/L	-	-	-	-	0,0004 g/L	0,0004 g/L	Gallagher
ADN de esperma de salmón		1,4 g/L	4 g/L	4 g/L	-	-	1,4 g/L	-	-
DPTA		-	-	0,0059 g/L	-	-	-	-	-
pH		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	Lapierre
Almacenamiento		0	4°	-	-	4°	4°	4°	Kirchner
Esterilización		Autoclave	Filtro	Autoclave	-	Autoclave	Autoclave	Filtro	Kirchner

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BME Vitaminas (100x) Solución	MilliporeSigma	B6891	Solución concentrada de vitaminas suplementarias.
Engarzadora, 30 mm	DWK Ciencias de la vida	224307	Engarzadora para fijar sellos de aluminio a botellas de suero.
D-(+)-Glucosa	MilliporeSigma	G7021	Glucosa sólida en polvo (isómero dextrógiro).
Bomba de diafragma ME 2 NT	MARCA ASPIRADORA	20730003	Bomba de vacío para filtración al vacío.
Emulsión de yema de huevo	HiMedia	FD045	Emulsión estéril de yema de huevo al 30% en suero fisiológico.
Ferritina, catiónica del bazo de caballo	MilliporeSigma	F7879	Solución de ferritina (proteína de almacenamiento de hierro).
Mechero Bunsen de seguridad FIREBOY plus	Integra Biociencias	144000	Mechero Bunsen con interfaz de usuario y características de seguridad.
Papel de pH Hydrion (1.0–14.0)	Laboratorio Micro Essential	94	Papel de prueba de pH para el rango de 1.0 a 14.0.
Papel de pH Hydrion (4,0–9,0)	Laboratorio Micro Essential	55	Papel de prueba de pH para el rango de 4.0 a 9.0.
Papel de pH Hydrion (6.0–8.0)	Laboratorio Micro Essential	345	Papel de prueba de pH para el rango de 6.0 a 8.0.
Dispositivo de seguridad Needle-Pro EDGE hipodérmico, 18 g	Smiths Medical	401815	Agujas de 18 G con tapas de seguridad.
Manómetro en línea	MilliporeSigma	20469	Manómetro de gas para controlar la presión de la botella.
Agitador Incubado Innova 42	Eppendorf	2231000756	Combinación incubadora/agitador orbital.
Jeringa Luer-Lok con aguja adjunta	Becton Dickinson	309580	Combinación de jeringa de 3 ml y aguja de 18 G.
Surtido de válvulas Luer	Instrumentos de precisión del mundo	14011	Válvulas para tubería de flujo de gas.
Agitador orbital LSE	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Agitador orbital para agitar los medios durante la filtración.
Sulfato de magnesio heptahidratado	MilliporeSigma	M2773	Sal de Epsom sólida (sulfato de magnesio heptahidratado).
Regulador de una etapa de aire médico con caudalímetro	Empresas occidentales	M1-346-15FM	Regulador de caudal de aire con medidor de 15 L/min.
Solución de aminoácidos MEM (50x)	MilliporeSigma	M5550	Solución concentrada de aminoácidos esenciales.
Solución de aminoácidos no esenciales MEM (100x)	MilliporeSigma	M7145	Solución concentrada de aminoácidos no esenciales.
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	MilliporeSigma	SLMP25SS	Filtro de jeringa estéril de membrana de polietersulfona de 0,22 μm.
Milli-Q Académico	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Sistema de filtración de agua estéril Milli-Q.
Monitor de oxígeno MiniOX 3000	MSA	814365	Monitor de porcentaje de oxígeno de flujo de gas.
Tampón MOPS (1 M, pH 9,0)	Bioproductos de Boston	BBM-90	Tampón MOPS para ajustar el pH del medio.
Mucina del estómago porcino	MilliporeSigma	M2378	Mucina (proteína glicosilada formadora de gel) en polvo.
Cloruro de potasio	MilliporeSigma	P9541	Sal sólida de cloruro de potasio.
Barras de agitación desechables de PTFE	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Barras de agitación magnéticas desechables.
Cinta de teflón con sello de rosca de PTFE	VWR	470042-938	Cinta de teflón para reforzar las conexiones del sistema de gas.
Cartucho de purificación Q-Gard 2	MilliporeSigma	QGARD00D2	Cartucho de purificación para sistema Milli-Q.
Botellas de almacenamiento de medios reutilizables	ThermoFisher Scientific	06-423A	Botellas para mezclar y almacenar medios de cultivo.
Tapón de goma, 30 mm, bromobutilo gris	DWK Ciencias de la vida	224100-331	Tapones de goma para botellas de suero.
Frasco de suero con graduaciones moldeadas, 500 ml	DWK Ciencias de la vida	223952	Frascos de suero de vidrio para cultivo sellado.
Juego de extensión de diámetro pequeño	Braun Medical	471960	Extensión de tubo con conectores luer lock.
Cloruro de sodio	MilliporeSigma	S3014	Sal sólida de cloruro de sodio.
Mezcla de metales traza, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Solución concentrada de metales traza fisiológicos.
Junta de aluminio sin revestimiento, 30 mm	DWK Ciencias de la vida	224187-01	Sellos de aluminio engarzados sobre la parte superior de los tapones de goma.