Cuantificación de unidades formadoras de colonias de bacterias asociadas al intestino en moscas Drosophila

Resumen

Fuente: Dodge, R., et al. Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)

Este video demuestra la cuantificación de las unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias asociadas al intestino en moscas Drosophila utilizando un enfoque de dilución y siembra en serie. Las muestras de moscas homogeneizadas que contienen bacterias intestinales se diluyen en serie, se siembran en agar y se incuban para permitir el crecimiento de la colonia. Luego, las imágenes de las placas se analizan utilizando un software para alinear, segmentar y contar colonias en cada punto, lo que permite una cuantificación precisa de UFC.

Protocolo

1. Homogeneización de moscas individualmente en una placa de PCR de 96 pocillos

1. Prepare platos batidores de cuentas con anticipación.
   1. Vierta perlas de vidrio de 0,5 μm (consulte la tabla de materiales) en la bandeja de medición de perlas. Extienda las cuentas en la bandeja de modo que todos los pocillos estén llenos y nivelados, y luego cepille el exceso de cuentas en un tubo cónico para recuperarlas.
   2. Coloque una placa de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con semifaldón (consulte la Tabla de materiales) boca abajo en la bandeja de medición y alinéela con los pocillos colocándola en la hendidura de la bandeja. Luego, dale la vuelta rápidamente para transferir las cuentas.
   3. Retire el exceso de perlas de la superficie de la placa de PCR y cúbrala con papel de aluminio. Inspeccione la placa de PCR para asegurarse de que todos los pocillos contengan perlas. Use una cuchara de pesaje si es necesario para agregar cuentas a un solo pozo. Si la electricidad estática hace que las perlas se peguen a las superficies de la placa, limpie o rocíe la parte posterior de la bandeja de medición y la placa de PCR con etanol al 70%.
   4. Cubra con papel de aluminio. Muchas placas se pueden preparar de esta manera y luego esterilizar en autoclave y almacenar para su uso posterior. Cuando esté listo para su uso, agregue 100 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada pocillo con la pipeta de 96 canales (consulte la tabla de materiales).
2. Esterilice la superficie de las moscas colonizadas por microbios con etanol al 70% antes de homogeneizarlas.
   1. Anestesiar las moscas con 100% de_CO2 durante 5 s. Transfiera moscas anestesiadas del vial a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando un embudo pequeño (Figura 1A-2). En este estudio, generalmente se agregaron 25 moscas por tubo.
   2. Rocíe inmediatamente ~ 1 ml de etanol al 70% en el tubo, cierre el tubo y mezcle por inversión durante 10 s. Luego, aspire el etanol con una pipeta P1000, teniendo cuidado de no aspirar moscas. Repita una vez más con etanol, luego dos veces con PBS estéril (Figura 1A-3).
3. Después del lavado final de PBS, cierre el tubo y, con la tapa hacia abajo, golpéelo con fuerza varias veces en el banco para que las moscas entren en la tapa.
4. Abra el tubo y dispense moscas en los pocillos con fórceps (Figura 1A-4). Coloque una mosca en cada pocillo (Figura 1A-5). Mantenga la placa en hielo mientras se carga para mantener a las moscas anestesiadas.
5. Selle la placa con una lámina termoselladora Thermal Bond (consulte la tabla de materiales).
   1. Primero, retire las gotas perdidas que estén cerca de los pozos, ya que pueden causar fugas en el sello de aluminio. Asegúrese de que el lado opaco del papel de aluminio esté orientado hacia abajo en el plato y el lado brillante hacia arriba hacia el sellador térmico. Presione el sellador térmico (consulte la Tabla de materiales) firmemente durante 5 s (Figura 1A-6). Pula con el aplicador manual (ver Tabla de materiales) para asegurar la lámina.
      NOTA: El sellado deficiente es una causa de pérdida de muestra.
6. Asegure la placa en el agitador de placas. Homogeneizar durante 5 min (Figura 1A-7). Gire la placa del talón durante 30 s en una mini-placa giratoria (consulte la tabla de materiales) a 350 x g para eliminar el líquido de la lámina de sellado.
7. Retire el papel de aluminio mientras sostiene la placa para no salpicar gotas de homogeneización de mosca fuera de los pocillos.

2. Dilución en serie del homogeneizado de mosca y manchado en placas de UFC

1. Coloque cuatro placas de crecimiento rectangulares de agar de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) (ver Tabla de materiales) en el gabinete de bioseguridad y retire sus tapas. En este protocolo, se utilizó agar MRS para el crecimiento de L. plantarum. Deje que estas placas se sequen durante al menos 10 minutos (20 minutos si están recién vertidas o frías por el almacenamiento).
   NOTA: Si las placas están húmedas, las gotas de la placa de 96 pocillos se juntarán y arruinarán los recuentos.
2. Prepare tres placas de dilución añadiendo 100 μl de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos utilizando una pipeta de 96 canales. Cargue una gradilla de puntas P20 en la pipeta de 96 canales.
3. Realice una dilución 1:10 aspirando 11,1 μL de homogeneizado de la placa de muestra preparada en la sección 1 (Figura 1A-8). Asegúrese de extraer del centro de los pocillos en lugar del fondo de los pocillos porque el homogeneizado de mosca y las perlas de vidrio obstruirán las pipetas. Las perlas se hunden y las partículas de mosca flotan, dejando la capa intermedia mayormente transparente.
4. Dispense los 11,1 μl en la primera placa de dilución, que ya contiene 100 μl de PBS estéril por pocillo. Mantenga la placa de dilución en el agitador de placas durante 10 s a 600 revoluciones por minuto (rpm). Mezcle nuevamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante cinco ciclos. Transfiera 11,1 μl de la primera placa de dilución a la segunda placa de dilución y repita los pasos de mezcla para las dos placas de dilución siguientes.
5. Realice el recubrimiento en serie de dilución como se describe a continuación.
   1. Recupere las placas de crecimiento del gabinete de bioseguridad.
   2. Comenzando con la placa más diluida, detecte 2 μL de cada pocillo en las placas de agar con la pipeta de 96 pocillos (Figura 1A-9).
      1. Baje el cabezal de la pipeta lentamente sobre la placa, teniendo cuidado de no clavar el agar. Examine la placa cuidadosamente y asegúrese de que se hayan dispensado todas las manchas; si no es así, agregue manualmente 2 μL a la posición adecuada. Verifique que las manchas de líquido penetren rápidamente en el agar y no se junten.
      2. Si las manchas se juntan, seque un nuevo juego de placas de agar frescas durante un período más largo y vuelva a hacer las manchas. Si hay varios tipos de placas (por ejemplo, diferentes medios o con antibióticos), búscalas también. Dispense cualquier solución restante nuevamente en la placa de dilución y continúe con la siguiente concentración más alta.
         NOTA: Al detectar diluciones, mezcle la siguiente dilución cinco veces para asegurarse de que el contenido de las puntas de la pipeta se elimine de la dilución anterior. Las placas de dilución se pueden almacenar durante >8 h a 4 °C sin afectar el recuento de colonias.
6. Repita el proceso de recubrimiento como se describe en el paso 2.5 para las placas de dilución restantes, progresando desde la más diluida hasta la más concentrada hasta la placa con el homogeneizado original.
7. Cuando todo el líquido haya sido absorbido por el agar, invierta las placas y colóquelas en la incubadora (Figura 1A-10). Para Lactiplantibacillus y Acetobacter de Drosophila, la temperatura óptima es de 30 °C en medios MRS. Incubar hasta que las colonias hayan alcanzado el tamaño óptimo: las colonias son lo suficientemente grandes como para verlas claramente, pero no tan grandes como para fusionarse o interferir con el crecimiento de las demás (consulte los resultados representativos para la cuantificación del tamaño óptimo).
   NOTA: Las condiciones óptimas de crecimiento dependen de la cepa y deben determinarse empíricamente. Para Lactiplantibacillus de Drosophila, el tiempo óptimo de incubación es de 26 h a 30 h en agar MRS. Para Acetobacter de Drosophila, el tiempo óptimo de incubación es de 30 h a 48 h en MRS, dependiendo de la cepa.
8. Después de la incubación, almacene las placas a 4 °C si es necesario hasta que estén listas para el recuento.

3. Cuantificación de las unidades formadoras de colonias (UFC)

1. Cuantifique las UFC fotografiando las placas y luego contando las colonias utilizando un software automatizado, como se detalla a continuación. Si las placas se almacenaron a 4 °C, primero deje que alcancen la temperatura ambiente para que no haya condensación en las placas, lo que produce deslumbramiento.
2. Organice las placas en una secuencia lógica y manténgalas en ese orden mientras fotografía: facilita el nombre de los archivos. Oriente todas las placas de modo que A1 esté en la esquina superior izquierda para todas las placas. Se recomienda etiquetar la esquina A1 con una identificación única para garantizar que no se mezclen las fotos. Apila cada serie de dilución en orden.
3. Retire la tapa de la placa y colóquela en el escenario con A1 orientado en la esquina correcta. La caja de fotos de la placa está optimizada para fotografiar estas placas de bandeja e incluye opciones de iluminación y filtro para obtener imágenes de colonias fluorescentes.
4. Imagina las placas. Utilice la cámara (consulte la tabla de materiales) con ajustes manuales para lograr un nivel de exposición constante entre las placas. Se recomienda un ajuste de distancia focal larga para minimizar la distorsión de la perspectiva. Capture la foto con un obturador remoto para minimizar el desenfoque del movimiento de la cámara.
5. Transfiera las imágenes a una computadora y cámbieles el nombre, incluido el nombre del experimento, el tipo de medio, el factor de dilución y cualquier otro detalle pertinente. Algunos sistemas operativos (consulte Tabla de materiales) tienen una función útil de cambio de nombre por lotes en Finder haciendo clic con el botón derecho en una selección de archivos.

4. Conteo automatizado de colonias utilizando la suite Count-On-It

1. Recorta las imágenes usando el complemento Croptacular proporcionado para ImageJ. Este complemento ayuda a dividir la imagen en una matriz ordenada de subregiones (por ejemplo, 8 x 12 para una placa de 96 pocillos). Las subregiones se contarán individualmente.
   1. Organice las imágenes que se procesarán para la cuantificación en una carpeta. Elija nombres de archivo que distingan las placas, ya que estos nombres de archivo se convierten en títulos de columna para cada conjunto de recuentos. Dentro de esta carpeta, crea subcarpetas llamadas "recortadas" y "recibos".
   2. Inicie Croptacular y haga clic en Aceptar para comenzar a recortar.
      NOTA: Se muestran los ajustes predeterminados y suelen ser suficientes. Dependiendo de la resolución de la imagen, la iluminación, el tamaño del punto, etc., puede ser útil ajustar los parámetros base.
   3. Si la imagen ya está recta, simplemente presione la barra espaciadora. De lo contrario, enderece la imagen dibujando una línea a lo largo de un borde que debe volverse horizontal. Vuelva a dibujar la línea tantas veces como sea necesario si la imagen aún no aparece enderezada.
   4. A continuación, dibuje un cuadro de límite del área para la que se va a realizar el conteo. Ajuste el tamaño y la proporción hasta que todas las manchas estén dentro de sus celdas. Arrastre el cursor fuera del cuadro de contorno para actualizar la cuadrícula. Cuando la cuadrícula se vea bien, presione Espacio.
   5. Asegúrese de que la siguiente imagen gire automáticamente al mismo ángulo que la primera; El complemento asume que todas las fotos están alineadas de la misma manera. Si esto es correcto, presione la barra espaciadora para continuar. De lo contrario, enderece la imagen como antes. La cuadrícula también recuerda la misma posición que la imagen anterior; ajuste si es necesario y, a continuación, presione la barra espaciadora.
2. Enumere las colonias en las placas utilizando el complemento Count-On-It: Gridiron proporcionado para ImageJ.
   1. Inicie Count-On-It > Gridiron. Utilice la misma configuración de cuadrícula que con Croptacular. Los usuarios pueden procesar por lotes una carpeta completa, analizar una sola imagen o comenzar desde la imagen actual.
   2. Establezca el umbral en función de un valor de intensidad de píxel superior e inferior. Haga que el umbral sea lo más estricto posible mientras selecciona todas las colonias. Idealmente, habrá algo de espacio entre las colonias seleccionadas, pero el software es capaz de segmentar las manchas hasta cierto punto. Haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo "Acción requerida" cuando el umbral sea satisfactorio.
   3. Para inspeccionar los resultados, amplíe y observe más de cerca los recuentos de colonias. Al hacer clic en cancelar, se abortará el complemento. Haga clic en Aceptar para continuar.
   4. En la primera imagen, asegúrese de que se da la opción de continuar o volver al menú de configuración, por ejemplo, para cambiar el tamaño mínimo de la colonia. Para continuar con el proceso por lotes, haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione una carpeta para mantener la tabla de recibos y resultados. Utilice la carpeta "recibos" o cree una nueva carpeta.
   5. Después de la primera imagen, las siguientes imágenes tendrán el mismo umbral predeterminado que la configuración anterior. Haga clic en Aceptar para usar esta configuración o ajustar la configuración. Si las fotos son consistentes y la configuración es precisa, haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo "Acción requerida".
      NOTA: Una vez que se completan todas las imágenes del lote, la tabla de resultados se guarda automáticamente en la misma carpeta que los recibos.
   6. Revise los recibos de conteo producidos por el software y corrija manualmente cualquier error de conteo. El complemento ImageJ es estadísticamente preciso, pero se producen errores. Pruebe los recibos para examinar los valores atípicos e identificar los recuentos erróneos. El software guarda los datos de la UFC como un archivo .csv en la misma carpeta que los recibos.
3. Analice los datos utilizando el software preferido por el usuario.

Resultados

Figura 1: El ensayo de colonización mide las UFC en cientos de moscas individuales utilizando un formato de placa de 96 pocillos. (A) Descripción general pictórica del ensayo de colonización y el método de cuantificación de al...

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