Tratamiento de bacterias con exudados de raíces vegetales para emular las interacciones in vitro planta-microbio

Resumen

Fuente: Yi, Y., et al. Interacción Planta-Microbio: Respuesta Transcripcional de Bacillus Mycoides a los exudados de la raíz de la papa. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la preparación y el tratamiento de cultivos de Bacillus mycoides para estudiar las interacciones planta-microbio. Describe los pasos desde rayar un cultivo de pasta e incubarlo en medio líquido hasta exponer las bacterias a los exudados de las raíces de las plantas bajo agitación. El proceso culmina con la recolección y congelación instantánea de las células bacterianas para el posterior análisis de los cambios en la expresión génica inducidos por los exudados.

Protocolo

1. Cultivo de bacterias

1. Rayar una cepa de B. mycoides de una reserva de glicerol a -80 °C en una placa de agar Luria-Bertani (LB) e incubar la placa a 30 °C durante la noche.

2. Inocular un medio líquido LB con una sola colonia de la placa y cultivar el cultivo en una incubadora agitadora a 200 rpm durante la noche a
30 °C.

2. Tratamiento y muestreo de bacterias

1. Para comparar la curva de crecimiento de las bacterias tratadas con exudados radiculares con un control negativo, preparar una serie de matraces que contengan 50 mL de medio líquido LB. Agregue 0,5 ml del cultivo bacteriano durante la noche a todos los matraces y agregue 0%, 5%, 10% o 15% (v/v) de exudado de raíz o agua desionizada estéril al medio, respectivamente.

2. Utilice un cultivo con agua desionizada en lugar de exudados de raíces como control. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) cada 1 h después. Genere una curva de crecimiento trazando los valores de OD₆₀₀ en función del tiempo.

3. Diluya un cultivo de B. mycoides durante la noche con 90 ml de medio LB precalentado a un OD₆₀₀ inicial de ~ 0,05 en un matraz de 300 ml. Añadir 10 mL de exudados de raíz al cultivo e incubarlo a 30 °C durante 1 h.

4. Utilice un tratamiento de agua desionizada estéril de 10 ml como control. Recoger las células del cultivo por centrifugación a 9.000 x g durante 2 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y congelar inmediatamente el pellet en nitrógeno líquido, luego almacenarlo a -80 °C hasta su uso.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hipoclorito de sodio	Sigma	CAS: 7681-52-9	10-15% de cloro activo
Caldo Luria-Bertani (LB)
Incubadora	Nuevo Brunswick Científico	Innova 4000
Espectrofotómetro	Thermo Fisher Scientific	Genesys 20
Nitrógeno líquido
Perlas de vidrio	Sigma	G8893	0,5 μm
Tubo de 2,0 ml con tapón de rosca			Libre de ARNasa
Tubo Eppendorf de 1,5 ml y 2,0 ml			Libre de ARNasa
Centrífuga	Eppendorf	5430