Ensayo de crecimiento bacteriano limitado por metales para estudiar el papel de los genes sensibles a los metales

Resumen

Fuente: Maurakis, S., et al. Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a metales y adquisición de metales de ligandos huéspedes. J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra un ensayo de crecimiento bacteriano limitado por metales para estudiar el papel de los genes sensibles a los metales. Las bacterias mutantes y de tipo salvaje cultivadas en un medio sin metal se incuban con ligando metálico y su crecimiento se monitorea mediante un lector de placas. En condiciones de agotamiento de metales, las bacterias de tipo salvaje expresan un receptor de superficie que permite la absorción y el crecimiento de metales, mientras que el mutante carece de este receptor, lo que resulta en un crecimiento restringido.

Protocolo

1. Preparación de soluciones madre de medio definido (MDL) tratadas con Chelex

1. Solución madre I
   1. Combinar cloruro de sodio o NaCl (233,8 g), sulfato de potasio o K₂SO₄ (40,0 g), cloruro de amonio o NH₄Cl (8,8 g), hidrogenofosfato dipotásico o K₂HPO₄ (13,9 g) y fosfato de dihidrógeno monopotásico o KH₂PO₄ (10,9 g) en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L.
   2. Esterilizar con filtro la solución y alícuota en tubos cónicos de 50 ml.
   3. Almacenar a -20 °C.
2. Solución madre II
   1. Combine ácido clorhídrico de tiamina o HCl (0,2 g), pirofosfato de tiamina-Cl (0,05 g), pantotenato de calcio (0,19 g) y biotina (0,3 g) en etanol al 50% (vol/vol) hasta un volumen final de 1 L.
   2. Alícuota en tubos cónicos de 50 ml y almacenar a -20 °C.
3. Solución madre III
   1. Combinar L-aspartato (4,0 g), L-glutamato (10,4 g), L-arginina (1,2 g), glicina (0,2 g), L-serina (0,4 g), L-leucina (0,72 g), L-isoleucina (0,24 g), L-valina (0,48 g), L-tirosina (0,56 g), L-prolina (0,4 g), L-triptófano (0,64 g), L-treonina (0,4 g), L-fenilalanina (0,2 g), L-asparagina-H₂O (0,2 g), L-glutamina (0,4 g), L-histidina-HCl (0,2 g), L-metionina (0,12 g), L-alanina (0,8 g), L-lisina (0,4 g) y glutatión reducido (0,36 g) en 500 ml de agua desionizada.
   2. Disuelva la L-cisteína (0,44 g) y la L-cistina (0,28 g) en un volumen mínimo (~1 ml) de 1 M HCl y agregue a la solución de aminoácidos anterior.
   3. Ajuste el pH de la solución con hidróxido de sodio (NaOH) 10 N hasta que se disuelvan todas las partículas. El pH final será de 10,0 a 11,0.
   4. Llevar el volumen final a 1 L con agua desionizada.
   5. Esterilizar con filtro la solución y alícuotas en volúmenes de 250 ml.
   6. Almacenar a -20 °C.
4. Solución madre IV
   1. Disolver la glucosa (200 g) en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L.
      NOTA: Es posible que la solución deba calentarse para disolver la glucosa.
   2. Esterilizar con filtro y alícuota la solución en tubos cónicos de 50 ml.
   3. Almacenar a -20 °C.
5. Solución madre V
   1. Combine hipoxantina (5,0 g), uracilo (5,0 g) y NaOH (4,0 g) en agua desionizada hasta obtener un volumen final de 1 L.
   2. Filtrar, esterilizar y alícuota en tubos cónicos de 50 ml.
   3. Almacenar a -20 °C.
6. Solución VI
   1. Prepare una solución de cloruro de calcio dihidratado de 1 M o CaCl 2-2H₂O (147 g/L) en agua desionizada. Filtrar, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente (RT).
7. Solución madre VII
   1. Prepare una solución de sulfato de magnesio anhidro (MgSO₄) de 1 M en agua desionizada. Filtrar, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.
8. Solución madre VIII
   1. Prepare una solución de bicarbonato de sodio 1 M (NaHCO₃) en agua desionizada. Filtrar, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.

2. Preparación de 4x concentrado estéril y 1x CDM

NOTA: Este procedimiento debe realizarse en cristalería estéril tratada con ácido o plástico para evitar la lixiviación de metales en las soluciones.

1. Combine las soluciones madre I (50 ml), II (20 ml), III (250 ml), IV (50 ml) y V (20 ml) con 20,0 g de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) y revuelva para mezclar.
2. Ajuste el pH a 7,4, luego lleve el volumen final a 500 ml con agua desionizada.
3. Lave la resina Chelex-100 en 1 L de agua desionizada para eliminar los conservantes antes de agregarla al concentrado estéril 4x. Para ello, añade 50 g de resina a 1 L de agua desionizada y remueve durante al menos 1 h. Retire el agua mediante filtración al vacío y use esta resina lavada para el paso 2.4.
4. Añadir 50 g de resina y remover lentamente durante exactamente 90 min.
5. Retire la resina mediante esterilización por filtro y almacene el concentrado estéril 4x a 4 °C.
6. Para preparar una concentración de trabajo de 1x de CDM, primero diluya el concentrado 4x con agua desionizada estéril, luego agregue la solución VI (125 μL por 500 mL de solución 1x), la solución VII (535 μL por 500 mL) y la solución VIII (10 mL por 500 mL).
   NOTA: Aunque todas las soluciones madre ya han sido esterilizadas, se recomienda volver a esterilizar la solución 1x después de la preparación.

3. Preparación de placas MDL

NOTA: La receta a continuación hace 1 L de medios para platos, pero es mejor prepararlos en volúmenes más pequeños. Todo se reduce proporcionalmente.

1. Agarosa lavada
   1. Disolver 50 g de agarosa en 1 L de agua desionizada, removiendo durante 1 h.
   2. Transfiera la solución a una botella centrífuga y centrifugue a 1.200 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Vierta con cuidado el sobrenadante y deséchelo.
   3. Agregue suficiente agua desionizada para volver a suspender el gránulo de agarosa, luego transfiera a un matraz de 1 L. Llevar a un volumen final de 1 L con agua desionizada y luego remover y centrifugar como en el paso 3.1.2. Deseche el sobrenadante.
   4. Agregue suficiente etanol al 100% para volver a suspender el gránulo, luego transfiéralo a un nuevo matraz de 1 L. Llevar a un volumen final de 1 L con etanol. Revuelva y centrifugue como en el paso 3.1.2.
   5. Repita el paso 3.1.4.
   6. Agregue metanol al gránulo de agarosa para volver a suspender, luego transfiera a un matraz de 1 L. Llevar a un volumen final de 1 L con metanol. Revuelva y centrifugue como en el paso 3.1.2.
   7. Repita el paso 3.1.6.
   8. Transfiera la agarosa lavada a una bandeja forrada con papel de aluminio y deje secar en una campana extractora. Cuando esté seco, transfiéralo a un recipiente sin metal para su almacenamiento a largo plazo.
2. Agregue 10 g de agarosa lavada y 5 g de fécula de papa a 750 ml de agua desionizada.
3. Autoclave durante 30 min a 121 °C, 100 kPa por encima de la presión atmosférica.
4. Deje que el medio se enfríe a ~65 °C, luego agregue 250 ml de 4X CDM, 250 μl de solución VI, 1,07 ml de solución VII y 20 ml de solución VIII.
5. Si lo desea, agregue los metales de su elección antes de verter las placas. La adición de quelantes no es necesaria para mantener las condiciones libres de metales.
6. Vierta en placas de Petri y deje que se solidifique.

4. Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae

NOTA: Para la mayoría de las aplicaciones, no es necesario estresar las bacterias antes de la inoculación de CDM. El paso inicial de duplicación en CDM y la dilución posterior son suficientes para agotar los gonococos de sus reservas internas de hierro y zinc. Como tal, los dos primeros pasos del siguiente procedimiento se llevan a cabo utilizando placas de agar hechas de Gonococcus (GC) base media que se han complementado con suplemento I de Kellogg y 12,5 μM de nitrato férrico (Fe(NO₃)₃). Si se desea una tensión metálica temprana, recomendamos preparar placas base medianas GC sin Fe(NO₃)₃ y con 5 μM TPEN (N,N,N',N'-tetrakis (2-piridilmetil) etilendiamina) para la quelación del zinc o 10 μM deferoxamina para la quelación del hierro. Toda la incubación se realiza a 37 °C con 5% de CO₂.

1. Dos días antes del experimento, el día -2, raye los gonococos de las existencias del congelador en placas medianas de GC e incube durante no más de 24 h.
2. En el día -1, raye colonias individuales en placas medianas frescas de GC. Intenta hacer esto 14-16 h antes del experimento de crecimiento.
3. El día del experimento, agregue 5-10 ml 1x CDM a un matraz de arma de mano con deflectores de 125 ml lavado con ácido y utilícelo para borrar un colorímetro Klett.
4. Use un hisopo estéril con punta de algodón para inocular CDM de colonias individuales sanas. Apunta a 20 unidades Klett.
   NOTA: Si no se dispone de un colorímetro Klett, también es adecuado un espectrofotómetro. No existe una fórmula de conversión universal para las unidades de Klett a OD, pero hay una guía aproximada disponible (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. Incubar agitando a 250 rpm hasta aproximadamente duplicar una masa (40 unidades Klett). Esto debería tomar entre 1 y 2 h.
6. En este punto, los cultivos se vuelven a diluir mediante la adición de un volumen suficiente de MDL para alcanzar la mitad de la densidad de cultivo inicial (por ejemplo, si 5 ml de cultivo han pasado de 20 a 40 unidades Klett, 15 ml de MDL lo reducirán a 10 unidades Klett), y el crecimiento continuará como en el paso 4.5. La cantidad específica de dilución inversa, tratamientos metálicos, etc., depende de las aplicaciones posteriores. A continuación damos tres ejemplos

5. Ensayos de crecimiento limitados por metales

NOTA: Estos ensayos describen premezclas de crecimiento prefabricadas. La preparación de estas mezclas se describe en la sección 6.

1. Durante la duplicación de masa en el paso 4.5, pretrate los pocillos de una microplaca de 96 pocillos con 10 premezclas. Además, designe tres pozos para que sirvan como espacios en blanco. A estos pocillos, agregue 10 μL de premezcla 10x y 90 μL de CDM.
2. Una vez que los cultivos en los matraces de armas laterales se hayan duplicado, agregue 100 μL de cada cultivo a un pocillo no utilizado en la microplaca y mida la densidad óptica a 600 nm (OD600). Esto se puede hacer con cubetas en un espectrofotómetro, pero con un mayor número de deformaciones dentro de un ensayo, esto puede volverse engorroso y, por lo general, no se recomienda a menos que su espectrofotómetro pueda medir directamente desde el brazo del matraz del brazo lateral.
   1. Mientras mide la OD, vuelva a colocar los matraces en la incubadora para asegurarse de que los gonococos sigan siendo viables.
3. Calcule la cantidad correcta de dilución requerida para llevar los cultivos a OD600 = 0.02. Las premezclas 10x tienen un efecto insignificante sobre el OD y pueden omitirse del cálculo.
4. Diluya los cultivos con CDM en pequeños tubos de cultivo y agregue suficiente volumen para diluir las premezclas 10x a 1x en la placa. Si hay un calentador de platos disponible, mantenga el plato a 37 °C mientras trabaja.
5. Incube la placa durante 8-12 h agitando en un lector de placas, tomando medidas OD600 a intervalos deseados.

6. Carga de metal de transferrina, S100A7 y calprotectina, y preparación de 10 premezclas

NOTA: Al igual que con la preparación de CDM, use vidrio o plástico lavado con ácido para la preparación de la solución.

1. Disolver la transferrina humana a 10 mg/ml (125 μM) en el tampón inicial (100 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 20 mM de NaHCO₃, pH = 8,4). S100A7 y calprotectina se suspenden en un tampón que consiste en 20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 10 mM de 2-mercapttoetanol y 1 mM de cloruro de calcio o CaCl₂, pH = 8,0).
   1. Agregue solución de ferración (100 mM de citrato de sodio, 100 mM de NaHCO₃, 5 mM de cloruro de hierro (III) hexahidratado o FeCl_{3-6H 2}O, pH = 8,4) a la solución de transferrina para lograr una saturación de hierro del 30% (p. ej., 75 μL de solución de ferración son adecuados para 5 mL de transferrina si se hace a 10 mg/mL).
   2. Agregue sulfato de zinc (ZnSO₄) a S100A7 o calprotectina en una proporción molar del 50% a la proteína para crear una saturación del 25% (cada molécula de proteína tiene dos sitios de unión al metal). Se pueden utilizar preparaciones de 100 μM S100A7 o calprotectina con 50 μM de ZnSO₄ .
   3. Para ambos casos, deje que se mezcle de extremo a extremo durante al menos 1 h para la carga de metal.
2. Prepare 4 L de tampón de diálisis (40 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 20 mM de NaHCO₃, pH = 7,4). Divídelo en dos volúmenes separados de 2 L y coloca uno a 4 °C.
3. Agregue las proteínas cargadas de metal a un casete de diálisis con una jeringa y dialícelas contra el primer volumen de tampón durante 4 h a RT.
4. Mueva el casete al segundo volumen de tampón y dialice durante la noche a 4 °C. Después de estos pasos, se deben eliminar los metales no unidos.
   NOTA: Recomendamos un ensayo de ácido bicinconínico para determinar las concentraciones de proteínas después de la diálisis.
5. Utilice una premezcla de transferrina 10x para la utilización de transferrina como única fuente de hierro.
   1. Prepare esta premezcla diluyendo al 30% de Fe-transferrina humana y apo-transferrina bovina (preparada a 125 μM como se describe para la transferrina humana, sin el paso de carga de hierro) a 75 μM y 30 μM, respectivamente, en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Una premezcla de control positivo reemplaza la 30% de Fe-transferrina con 75 μM de Fe(NO)₃, y una premezcla de control negativo omite cualquier hierro añadido, reteniendo solo la apo-transferrina bovina. En el ensayo de crecimiento, diluir 10 μL de estos concentrados con 90 μL de cultivo. Las concentraciones finales son 7,5 μM, 30% de Fe-transferrina humana y 3 μM de apotransferrina bovina.
6. Utilice una versión modificada de la premezcla de transferrina 10x para la utilización de S100A7 o calprotectina como única fuente de zinc.
   1. Para una premezcla de control positivo, incorpore 50 μM de ZnSO₄ en la premezcla de transferrina. Para un control negativo, incorpore 50 μM de TPEN y omita el zinc. Luego, tome 10 μL de cada uno de estos para cada muestra que necesite y mueva ese volumen a un nuevo tubo. Agregue a esto la mitad del volumen de PBS estéril. Por ejemplo, si 10 pocillos recibirán la premezcla de control positivo, tome 100 μL de premezcla, muévala a un nuevo tubo y agregue 50 μL de PBS. Haz lo mismo con el control negativo.
   2. Para hacer la premezcla de S100A7 o calprotectina, tome 10 μL de la premezcla de control negativo por pocillo necesario, muévase a un nuevo tubo y agregue la mitad de ese volumen del 25% de Zn-S100A7 o calprotectina. En el ensayo de crecimiento, utilizar 15 μL de premezcla y diluir con 85 μL de cultivo. Las concentraciones finales de las transferrinas siguen siendo las mismas que en el paso 8.5, con 5 μM añadidos de Zn, TPEN o S100A7/calprotectina.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matraces de arma de mano de 125 ml	Bellco	2578-S0030	Debe ser pedido a medida
2-Mercaptoetanol	VWR	M131	Abierto en campana extractora
Papel de 3 mm	Salud GE	3030-6461	Llamado "papel de filtro" en el texto
Agarosa	Biolone	BIO-41025	Polvo
Cloruro de amonio	Sigma-Aldrich	Referencia A9434	Polvo
Transferrina bovina	Sigma-Aldrich	T1428	Polvo
Cloruro de calcio dihidrato	Sigma-Aldrich	C5080	Polvo
Pantotenato de calcio	Sigma-Aldrich	C8731	Polvo
Calprotectina	N/A	N/A	Nos lo proporciona un colaborador
Resina Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Lavar con agua desionizada antes de usar
Hisopo estéril con punta de algodón	Puritano	25-806	El algodón es mejor que el poliéster para esta aplicación
Deferoxamina	Sigma-Aldrich	D9533	Polvo
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	Polvo
Casete de diálisis	Termo	66380	Remoje previamente en el tampón antes de usar
Etanol	Koptec	V1016	Líquido inflamable, almacenar en gabinete de inflamables
Cloruro férrico	Sigma-Aldrich	F7134	Irritante, no inhalar
Nitrato férrico no hidratado	Sigma-Aldrich	F1143	Irritante, no inhalar
Base media GC	Difco	228950	Polvo, ya contiene agar
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	Polvo
HEPES	Pescador	L-15694	Polvo
Transferrina humana	Sigma-Aldrich	T2030	Polvo
Hipoxantina	Sigma-Aldrich	H9377	Polvo
Colorímetro Klett	Manóstato	37012-0000	Utiliza la transmisión de color para evaluar la densidad de cultivo
L-alanina	Sigma-Aldrich	Referencia A7627	Polvo
L-arginina	Sigma-Aldrich	A5006	Polvo
L-asparagina monohidrato	Sigma-Aldrich	Referencia A8381	Polvo
L-aspartato	Sigma-Aldrich	Referencia A9256	Polvo
Clorhidrato de L-cisteína	Sigma-Aldrich	C1276	Polvo
L-cistina	Sigma-Aldrich	C8755	Polvo
L-glutamato	Sigma-Aldrich	G1251	Polvo
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	Polvo
Monoclorhidrato de L-histidina	Sigma-Aldrich	H8125	Polvo
L-isoleucina	Sigma-Aldrich	I2752	Polvo
L-leucina	Sigma-Aldrich	L8000	Polvo
L-lisina	Sigma-Aldrich	L5501	Polvo
L-metionina	Sigma-Aldrich	M9625	Polvo
L-fenilalanina	Sigma-Aldrich	P2126	Polvo
L-prolina	Sigma-Aldrich	P0380	Polvo
L-serina	Sigma-Aldrich	S4500	Polvo
L-treonina	Sigma-Aldrich	T8625	Polvo
L-triptófano	Sigma-Aldrich	T0254	Polvo
L-tirosina	Sigma-Aldrich	T3754	Polvo
L-valina	Sigma-Aldrich	V0500	Polvo
Sulfato de magnesio	Sigma-Aldrich	M7506	Polvo
Metanol	VWR	BDH1135-4LP	Líquido inflamable, almacenar en gabinete de inflamables
Fosfato de potasio dibásico	Sigma-Aldrich	60356	Polvo
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	P9791	Polvo
Sulfato de potasio	Sigma-Aldrich	P0772	Polvo
Fécula de patata	Sigma-Aldrich	S4251	Polvo
Reducción del glutatión	Sigma-Aldrich	G4251	Manéjelo con cuidado. Puede oxidarse fácilmente.
S100A7	N/A	N/A	Nos lo proporciona un colaborador
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S5761	Polvo
Cloruro de sodio	VWR	470302	Polvo
Citrato de sodio	Pescador	S279	Polvo
Hidróxido sódico	Acros Organics	383040010	Altamente higroscópico
Clorhidrato de tiamina	Sigma-Aldrich	T4625	Polvo
Pirofosfato de tiamina	Sigma-Aldrich	C8754	También se llama cocarboxilasa
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Polvo
Tris	VWR	497	Polvo
Uracilo	Sigma-Aldrich	U0750	Polvo
Sulfto de zinc heptahidratado	Sigma-Aldrich	204986	Irritante, no inhalar