Detección de los transportadores de metales de superficie en Neisseria gonorrhoeae mediante transferencia de puntos

Resumen

Fuente: Maurakis, S. y Cornelissen, C. N. Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a metales y adquisición de metales de ligandos huéspedes. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra el procedimiento para detectar transportadores de metales de superficie en Neisseria gonorrhoeae cultivados en condiciones limitadas de metales mediante un ensayo de transferencia de puntos, que involucra la unión de ligandos, la detección de anticuerpos y la visualización colorimétrica.

Protocolo

1. Detección de unión de ligandos por transportadores metálicos de membrana externa

1. Volver a diluir los cultivos con tres volúmenes de CDM (medio definido tratado con chelex).
2. A continuación, incubar agitando durante 4 h.
3. Poco antes de la marca de 4 h, corte tres trozos de papel de filtro y un trozo de nitrocelulosa al tamaño aproximado necesario para caber en un aparato de transferencia de puntos. Remoje previamente la nitrocelulosa en agua desionizada, luego ensamble el aparato con papel de filtro debajo de la nitrocelulosa.
4. A las 4 h, registre las densidades celulares y estandarice a una densidad final adecuada.
5. Pipetee los cultivos celulares sobre la nitrocelulosa y deje suficiente tiempo para que el papel de filtro absorba todo el líquido.
6. Desmonte el aparato, deje que la transferencia se seque y bloquee la membrana de nitrocelulosa durante 1 h en albúmina de suero bovino al 5% o leche descremada (p / v) en solución salina tamponada con Tris.
7. Vuelva a montar el aparato de transferencia de puntos, reemplazando el papel de filtro con una película de parafina para crear un sello a prueba de fugas debajo de la nitrocelulosa.
8. Diluir el ligando de unión al metal de interés a 0,2 μM en células bloqueadoras y de sonda durante 1 h.
9. Extrae el líquido con una aspiradora, lava la mancha y luego sigue los procedimientos inmunológicos estándar para desarrollar la señal. Los pasos de lavado se pueden hacer dentro o fuera del aparato.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matraces de arma de mano de 125 ml	Bellco	2578-S0030	Debe ser pedido a medida
2-Mercaptoetanol	VWR	M131	Abierto en campana extractora
Papel de 3 mm	Salud GE	3030-6461	Llamado "papel de filtro" en el texto
Bloqueador de grado de transferencia	Bio-Rad	170-6404	Leche en polvo descremada
Albúmina sérica bovina	Roche	3116964001	Polvo
Calprotectina	N/A	N/A	Nos lo proporciona un colaborador
Resina Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Lavar con agua desionizada antes de usar
Hisopo estéril con punta de algodón	Puritano	25-806	El algodón es mejor que el poliéster para esta aplicación
Aparato de transferencia de puntos	Schleicher & Schwell	10484138	Cierre la tapa lo más herméticamente posible antes de cargar la muestra
Etanol	Koptec	V1016	Líquido inflamable, almacenar en gabinete de inflamables
Colorímetro Klett	Manóstato	37012-0000	Utiliza la transmisión de color para evaluar la densidad de cultivo
Metanol	VWR	BDH1135-4LP	Líquido inflamable, almacenar en gabinete de inflamables
Nitrocelulosa	Salud GE	10600002	Mantener en funda protectora hasta su uso
S100A7	N/A	N/A	Nos lo proporciona un colaborador
Cloruro de sodio	VWR	470302	Polvo
Tris	VWR	497	Polvo