Medición de las tasas de traducción errónea de Mycobacterium smegmatis mediante un sistema indicador de GFP/luciferasa

Resumen

Fuente: Chen, Y., et al., Medición de tasas de traducción errónea de micobacterias específicas con sistemas informadores de ganancia de función. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra un método para cuantificar la traducción errónea en Mycobacterium smegmatis utilizando un GFP inducible y un sistema reportero de luciferasa mutante secretada. Muestra cómo se mide la luminiscencia resultante de una traducción incorrecta y se compara con la fluorescencia de GFP para evaluar el impacto de una molécula de prueba en la precisión de la traducción.

Protocolo

1. Reportero de luciferasa nanoluc (Nluc) / proteína fluorescente verde (GFP)

NOTA: Para obtener una representación visual de este método, consulte la Figura 1.

1. Inocular la cepa reportera bacteriana de stock de -80 °C con 2 mL de medio 7H9. Agitar a 37 °C durante 1 o 2 días hasta que OD₆₀₀ alcance la fase estacionaria (OD >3).
2. Subcultivar a 50 mL de medio 7H9 y crecer hasta que OD₆₀₀ alcance la fase estacionaria tardía (>4).
3. Antes de alícuotas de las bacterias a una placa de 96 pocillos, agregue anhidrotetraciclina (ATC) a una concentración final de 50 ng/ml y mezcle bien. La inducción del cultivo a granel asegura que todos los pocillos contengan la misma cantidad de inductor y que la inducción del reportero esté sincronizada. Alícuota de las bacterias a una placa transparente de fondo redondo de 96 pocillos, con 100 μL de volumen en cada pocillo.
4. Para detectar moléculas pequeñas que afecten las tasas de traducción incorrecta, agregue el compuesto a la concentración indicada para seleccionar pocillos. A efectos del presente protocolo, utilice kasugamicina (en las dosis indicadas en la figura 2) como ilustración. Agregue diferentes dosis de kasugamicina a los pocillos seleccionados (cada grupo experimental debe contener al menos dos réplicas biológicas).
5. Agitar e inducir las muestras a 37 °C durante 16-20 h.
   NOTA: Es necesario sellar la placa con película. Además, todos los pozos de borde deben llenarse con al menos 200 μL de agua estéril para limitar la evaporación de los pocillos de prueba.
6. Tome 80 μL de cada pocillo, utilizando una pipeta multicanal, y transfiera las muestras a una placa negra de 96 pocillos (que maximiza la medición de la señal de fluorescencia). Mida la señal GFP con un luminómetro con 20 ms como tiempo de integración.
7. Después de medir la señal GFP, centrifugar la placa a 3.220 x g durante 10 min. Transfiera 50 μL del sobrenadante a una placa de 96 pocillos de fondo blanco (que maximiza la medición de la señal de luminiscencia), agregue 50 μL de sustrato Nluc a cada pocillo, mézclelos bien y mida la luminiscencia con un luminómetro con 1.000 ms como tiempo de integración.
8. Determine la relación Nluc / GFP dividiendo los valores de luminiscencia de Nluc corregidos por la fluorescencia de GFP: esta medida (en unidades arbitrarias) es una medida relativa de aspartato para la traducción errónea de la asparagina.

Resultados

Figura 1: Esquema de la medición de la tasa de traducción errónea Nluc-GFP reporter. Un cultivo fresco de M. smegmatis, transformado con los reporteros Nluc y GFP, se cultiva a un volumen suficiente para que se prueben todas las placas (...

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