Recolección de líquido de lavado broncoalveolar de un modelo de ratón infectado con Haemophilus influenzae no tipificable

Resumen

Fuente: Venuprasad, K., et al. Administración intratraqueal de Haemophilus influenzae en modelos de ratón para estudiar la inflamación de las vías respiratorias. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la recolección y el procesamiento del líquido de lavado broncoalveolar de un ratón sacrificado infectado con Haemophilus influenzae no tipificable para su análisis posterior.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Colección de líquido de lavado broncoalveolar (BALF)
   1. Sacrificar al ratón por dislocación cervical 24 horas después de la infección.
   2. Abra la cavidad abdominal del ratón con unas tijeras anatómicas, corte la aorta ventral para sangrar y exponga la parte ventral del pulmón.
   3. Exponga la tráquea e intubarla con un catéter de calibre 20. Instilar 0,8 ml de tampón BALF (1x PBS (solución salina tamponada con fosfato), dextrosa al 0,1%, 10 U/ml de heparina) y recoger el lavado mediante aspiración suave. Repita este procedimiento tres veces.
   4. Cuente el número total de células en 100 μl de suspensión de BALF utilizando un hemocitómetro con un aumento de 10X con tinción de azul de tripano.
   5. Prepare portaobjetos para la tinción de Giemsa modificada. Alícuotas 100 μl de BALF en los pocillos apropiados de la citocentrifugación y centrifugar a 500 x g durante 5 min. Seque los portaobjetos durante 10 min y tiña las células con tinción de Giemsa modificada de acuerdo con los protocolos del fabricante.
   6. Las células restantes se pueden utilizar para análisis posteriores, como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), la microscopía confocal, la expresión génica y el western blot.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dextrosa anhidra	Themo Científico	Referencia R01300
Heparina	Hospira, Inc	RL-3010
Aguja de jeringa 20/26G	BD	(REF305115/175)
Jeringa de 1 ml	BD	REF 309602
Catéter 20GA	BD	REF 381433
Pinza #5 Acero inoxidable, 11cm de largo	KentScientific	INS600095
Tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml	BD	REF 352058
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Laboratorios de luz	A-7001-R
1X PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Gibco	10010-023
Tampón de lisis de glóbulos rojos (10X)	Bioleyenda	420301