Sincronización de cultivos de cianobacterias y compactación del ADN impulsada por ciclos de luz y oscuridad

Resumen

Fuente: Murata, K. et. al., Visualización de la compactación del ADN en cianobacterias mediante tomografía crioelectrónica de alto voltaje. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el cultivo sincrónico de cianobacterias bajo ciclos de luz-oscuridad para estudiar la compactación del ADN regulada por el circadiano. La microscopía de fluorescencia revela ADN condensado en puntos de tiempo definidos, lo que confirma la alineación del ciclo celular en toda la población.

Protocolo

1. Cultivo sincrónico de cianobacterias

1. Cultivo Synechococcus elongatus PCC 7942 en una placa esterilizada de medio azul verdoso 11 (BG 11) (en una placa de Petri de plástico estéril de 9 cm) que contiene agar al 1,5% (p/v) y tiosulfato de sodio al 0,3% (p/v).
2. Coloque las placas en una cámara de crecimiento a 23 °C con una intensidad de luz de 50 μE/m²/s y sométalas a ciclos de luz de 12 h / 12 h de oscuridad.
3. Transfiera las celdas a placas de agar BG11 frescas una vez a la semana.
   NOTA: Los cultivos en el agar aparecerán como bandas verdes de células que proliferan activamente después de una semana en estas condiciones de cultivo.
4. Tome grupos verdes de células con un bucle de alambre esterilizado con llama y raye las células en una placa de agar BG11 nueva. Haga esto en un banco limpio.

2. Monitoreo por microscopía de fluorescencia

1. Utilice células cultivadas en la placa de agar durante 6 días para observar la compactación del ADN. Recoja las células de la placa al final del período de luz vertiendo 1 ml de solución de sacarosa 0,2 M sobre las células. Repita vertiendo la solución sobre las células para que se recolecten la mayoría de las células. Transfiera la solución de células suspendidas a un microtubo para la tinción de ADN.
2. Agregue una solución de tinción de ADN (p. ej., Hoechst 33342) a 500 μL de la solución celular suspendida en un microtubo hasta una concentración final de 1 μg/mL. Luego, mantenga el tubo en la oscuridad durante 10 min.
3. Centrifugar durante 1 min a 2.000 x g para sedimentar las células. Deseche el sobrenadante y agregue 10 μL de solución de sacarosa 0,2 M para obtener una suspensión celular densa.
4. Transfiera 1 μL de la solución que contiene las células teñidas a un vaso de portaobjetos, coloque un cubreobjetos y observe con un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro ultravioleta (UV) utilizando una lente de objetivo con un aumento de 100X y aceite de inmersión.
5. Confirme que la compactación del ADN se observa en este punto en la mayoría de las células.

Materiales