Síntesis de antígenos proteicos de membrana estabilizados con nanodiscos mediante un sistema libre de células

Resumen

Fuente: Gilmore, S. F., et al. Producción a escala libre de células y adición adyuvante a una proteína principal de membrana externa recombinante de Chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra la síntesis libre de células de antígenos de proteínas de membrana estabilizados con nanodiscos utilizando un sistema de doble compartimento. El dispositivo mantiene las condiciones óptimas para una síntesis eficiente de proteínas, un plegamiento adecuado y una integración estable en nanodiscos.

Protocolo

Producción libre de células de las principales partículas de nanolipoproteínas de telodendrímero de la membrana externa (MOMP-tNLP) para formulaciones de vacunas de subunidades

1. Preparar MOMP-tNLP utilizando métodos libres de células.
   1. Dos horas antes de configurar la reacción libre de células, abra el kit de expresión de proteínas libres de células procariotas y descongele uno de los tampones de reconstitución. Una vez descongelado, agregue una tableta de cóctel inhibidor de proteasa sin ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y deje que se disuelva por completo.

2. Siga este protocolo utilizando un kit diseñado para ejecutar reacciones de 5 x 1 ml.

   NOTA: Una producción típica a escala es de 3 x 1 ml.

   1. Para cada reacción de 1 ml, agregue 525 μl de tampón de reconstitución al frasco de lisado de E. coli y enrolle suavemente para disolver. Agregue 250 μL de tampón de reconstitución al frasco que contiene aditivos de reacción (por ejemplo, trifosfato de adenosina, trifosfato de guanosina) y enrolle suavemente para disolver.
   2. Agregue 8,1 ml de tampón de reconstitución a la botella de alimentación de reacción, vuelva a tapar con un tapón de goma (tenga cuidado de no tocar el interior del tapón de goma) e invierta / enrolle suavemente para disolver.
   3. Agregue 3 ml de tampón de reconstitución a la botella de mezcla de aminoácidos, vuelva a tapar con un tapón de goma e invierta / enrolle suavemente para disolver.
      NOTA: Tenga cuidado de no tocar el interior del tapón de goma, ya que esto puede provocar contaminación.
   4. Agregue 1,8 ml de tampón de reconstitución a la botella de metionina, enrolle suavemente para disolver y luego guárdelo en hielo hasta su uso.
       
3. Prepara la solución de reacción.
   1. Al frasco de lisado de E. coli , agregue 225 μL de mezcla de reacción reconstituida, 270 μL de mezcla de aminoácidos reconstituidos sin metionina y 30 μL de metionina reconstituida. Además, agregue 400 μL de la mezcla de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)/telodendrímera, 15 μg de plásmido MOMP y 0,6 μg de plásmido Δ49ApolipoproteinA1. Enrolle / agite suavemente para mezclar.
      NOTA: Asegúrese de que ambos plásmidos estén construidos a partir de la misma columna vertebral de plásmidos. No haga vórtices.
   2. Tome 20 μL de la solución total y déjela a un lado en un tubo de 1,5 ml para la reacción de control que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) (ver más abajo).
       
4. Prepare la solución de alimentación. A la botella de mezcla de pienso, agregue 2,65 ml de mezcla de aminoácidos reconstituidos sin metionina y 300 μl de metionina reconstituida. Enrolle / agite suavemente para disolver.
   NOTA: En este momento, el tampón de reconstitución no utilizado y la metionina se pueden devolver al congelador para su almacenamiento.
    
5. Transfiera 1 ml de la solución de reacción a la cámara de reacción interna provista en el kit de reacción sin células y selle cuando esté llena. Transfiera 10 ml de la solución de alimentación a la cámara exterior del recipiente de reacción y selle.
   NOTA: ¡No llene demasiado las cámaras! La presencia de burbujas de aire en la parte superior de la cámara de reacción interna y la cámara de alimentación interna afectará negativamente la reacción. Cualquier solución de reacción restante se puede colocar en un tubo de 1,5 ml y dejar que se mezcle junto al recipiente principal.
    
6. Agregue 0,5 μL del plásmido de control GFP (0,5 mg/mL) a la mezcla de reacción de 20 μL previamente alícuota.
   NOTA: Muchos kits se suministran con un plásmido de control para fines de control de calidad. La mayoría de los plásmidos que expresan GFP con un promotor T7 y un sitio de unión al ribosoma (RBS) de E. coli también se pueden usar como plásmido de control.
    
7. Coloque la reacción en un agitador a 300 rpm, 30 °C durante un máximo de 18 h. Para verificar que la reacción fue exitosa, use una fuente de luz UV para verificar la fluorescencia debido a la síntesis de la GFP de control (Figura 1) después de tan solo 15 minutos de incubación.
   NOTA: Es posible que estas condiciones, particularmente la temperatura, deban optimizarse para la expresión de otras proteínas de membrana.

Resultados

Figura 1: Expresión y purificación de MOMP-tNLP. (A) Imagen de tubos que contienen pequeñas alícuotas de una reacción libre de células que expresa con éxito los controles de GFP que iluminan bajo una fuente de luz UV...

Materiales