Western Blot para evaluar la integridad estructural de un antígeno de vacuna bacteriana

Resumen

Fuente: Gilmore, S. F. et al. Producción a escala libre de células y adición adyuvante a una proteína principal de membrana externa recombinante de Chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el uso de Western blot para evaluar la integridad estructural de la proteína principal de la membrana externa (MOMP) dentro de complejos de vacunas basados en nanopartículas. Describe los pasos clave involucrados en la transferencia de proteínas, el etiquetado de anticuerpos y las imágenes de fluorescencia.

Protocolo

1. Western blot

1. Para la transferencia occidental, resuelva la proteína principal de la membrana externa (MOMP) – partículas de nanolipoproteína de telodendrímero (tNLP) mediante SDS-PAGE y transfiera los geles utilizando un sistema comercial de transferencia seca con configuraciones estándar de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   1. Retire las transferencias de la pila una vez completada la transferencia e incube cada transferencia durante la noche a 4 °C en un tampón de bloqueo adecuado que contenga 0,2% de Tween 20 y 0,5 mg/ml de anticuerpo monoclonal (MAb) 40 o 0,2 mg/ml de anticuerpo anti-His-His-tag dirigido contra la etiqueta His de la proteína Δ49ApoA1.
      NOTA: Las diluciones de anticuerpos utilizadas para la transferencia son 1:1.000 para MAb40 y 1:500-1.000 para el anticuerpo MAbHIS.
   2. Lave cada transferencia 3 veces durante 5 minutos con PBS-T (1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,2% Tween 20, pH 7,4).
   3. Incube las transferencias durante 1 h en un tampón de bloqueo que contenga un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo (p. ej., colorante infrarrojo (IRDye)) a una dilución de 1:10.000.
   4. Vuelva a lavar las manchas 3 veces durante 5 minutos con PBS-T. Use un generador de imágenes de fluorescencia para obtener imágenes de las manchas después del lavado final.

Materiales