Preparación y transformación de bacterias mediante electroporación de alto voltaje

Abstract

Fuente: Stefan, A., et al., Los beneficios multifacéticos de la coexpresión de proteínas en Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra el procedimiento para transformar Escherichia coli con un plásmido portador de un gen de resistencia a los antibióticos, incluida la preparación celular, la electroporación, la recuperación y la selección de transformadores.

Protocol

1. Aislamiento de cotransformadores de E. coli

1. Preparar células electrocompetentes de la cepa de E. coli apropiada para ser transformadas. Transfiera a 1 ml de medio Luria-Bertani (LB) (triptona, extracto de levadura, NaCl a 10, 5 y 10 g/L, respectivamente) una sola colonia de la cepa de su elección, e incube a 37 °C en condiciones de agitación de 180 rpm. Diluir el precultivo 1:500 en 25 ml de medio LB fresco e incubar el cultivo a 37 °C.
2. En la fase logarítmica (0,6 OD o densidad óptica), centrifugar la suspensión celular a 5.000 x g durante 20 min y volver a suspender el sedimento en agua de glicerol estéril helada al 10%, v/v en la mitad del volumen de cultivo original. Repita este paso 4 veces, reduciendo a la mitad el volumen de ressuspensión. Finalmente, vuelva a suspender el gránulo en glicerol / agua y divida la suspensión celular en alícuotas de 50 μl. Conservar las alícuotas a -80 °C hasta 6 meses.
3. Disuelva el plásmido deseado en agua estéril suplementada con EDTA 0,5 mM (ácido etilendiaminotetraacético). Descongele una alícuota de células electrocompetentes en hielo y mezcle con una cantidad adecuada (2,5-5 ng) de vector. Dispense la mezcla en una cubeta de 0,1 cm apta para electroporación y aplique 1,8 kV.
4. Transfiera inmediatamente las células electroporadas a 1 ml de medio SOC (caldo súper óptimo con represión de catabolitos) (medio LB suplementado con 0,2% p/v de glucosa, 10 mM MgCl₂, 2,5 mM KCl), incube durante 1 hora bajo agitación y finalmente transfiera 100 μl de alícuotas a placas de Petri que contengan agar LB con el antibiótico adecuado. Incubar O/N a 37 °C.
5. Purifica los transformadores rayando colonias individuales en placas de Petri.

Materials