Preparación y transformación de bacterias mediante electroporación de alto voltaje

Resumen

Fuente: Stefan, A., et al., Los beneficios multifacéticos de la coexpresión de proteínas en Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra el procedimiento para transformar Escherichia coli con un plásmido portador de un gen de resistencia a los antibióticos, incluida la preparación celular, la electroporación, la recuperación y la selección de transformadores.

Protocolo

1. Aislamiento de cotransformadores de E. coli

1. Preparar células electrocompetentes de la cepa de E. coli apropiada para ser transformadas. Transfiera a 1 ml de medio Luria-Bertani (LB) (triptona, extracto de levadura, NaCl a 10, 5 y 10 g/L, respectivamente) una sola colonia de la cepa de su elección, e incube a 37 °C en condiciones de agitación de 180 rpm. Diluir el precultivo 1:500 en 25 ml de medio LB fresco e incubar el cultivo a 37 °C.
2. En la fase logarítmica (0,6 OD o densidad óptica), centrifugar la suspensión celular a 5.000 x g durante 20 min y volver a suspender el sedimento en agua de glicerol estéril helada al 10%, v/v en la mitad del volumen de cultivo original. Repita este paso 4 veces, reduciendo a la mitad el volumen de ressuspensión. Finalmente, vuelva a suspender el gránulo en glicerol / agua y divida la suspensión celular en alícuotas de 50 μl. Conservar las alícuotas a -80 °C hasta 6 meses.
3. Disuelva el plásmido deseado en agua estéril suplementada con EDTA 0,5 mM (ácido etilendiaminotetraacético). Descongele una alícuota de células electrocompetentes en hielo y mezcle con una cantidad adecuada (2,5-5 ng) de vector. Dispense la mezcla en una cubeta de 0,1 cm apta para electroporación y aplique 1,8 kV.
4. Transfiera inmediatamente las células electroporadas a 1 ml de medio SOC (caldo súper óptimo con represión de catabolitos) (medio LB suplementado con 0,2% p/v de glucosa, 10 mM MgCl₂, 2,5 mM KCl), incube durante 1 hora bajo agitación y finalmente transfiera 100 μl de alícuotas a placas de Petri que contengan agar LB con el antibiótico adecuado. Incubar O/N a 37 °C.
5. Purifica los transformadores rayando colonias individuales en placas de Petri.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar-agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A9518
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Kcl	Sigma-Aldrich	P9541
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
Triptona	Sigma-Aldrich	95039
Extracto de levadura	Fluka	70161
Cubetas 0,1 cm	BioRad	1652089	Para electroporación
Centrífuga 5415R	Eppendorf
Centrífuga Allegra 21R	Beckman
Electroporación de Gene Pulser II	BioRad