Evaluación de la frecuencia de mutaciones en bacterias mediante el ensayo de beta-glucosidasa

Abstract

Fuente: Stefan, A., et al. Los beneficios multifacéticos de la coexpresión de proteínas en Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), (2015).

Este video demuestra la evaluación de la frecuencia de mutación en bacterias mediante un ensayo de beta-glucosidasa. Los cultivos bacterianos que expresan una ADN polimerasa deficiente en corrección de pruebas se recolectan durante generaciones sucesivas. Los errores de replicación causados por la reducción de la corrección pueden activar un gen de beta-glucosidasa suprimido. Después de la centrifugación y la permeabilización, se agrega un sustrato y se mide la actividad enzimática para cuantificar la frecuencia de mutación en las muestras.

Protocol

1. Aislamiento de cotransformadores de Escherichia coli o E. coli

1. Preparar células electrocompetentes de la cepa de E. coli apropiada para ser transformadas. Transfiera a 1 ml de medio Luria-Bertani (LB) (triptona, extracto de levadura, cloruro de sodio o NaCl a 10, 5 y 10 g/L, respectivamente) una sola colonia de la cepa de su elección, e incube a 37 °C en condiciones de agitación de 180 rpm. Diluir el precultivo 1:500 en 25 ml de medio LB fresco e incubar el cultivo a 37 °C.
2. En la fase logarítmica (0,6 O.D.), centrifugar la suspensión celular a 5.000 x g durante 20 min, y volver a suspender el pellet en un 10%, v/v de agua de glicerol estéril helada en la mitad del volumen de cultivo original. Repita este paso 4 veces, reduciendo a la mitad el volumen de resuspensión cada vez. Finalmente, vuelva a suspender el gránulo en glicerol / agua y divida la suspensión celular en alícuotas de 50 μl. Conservar las alícuotas a -80 °C hasta 6 meses.
3. Disuelva el plásmido deseado en agua estéril suplementada con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 mM. Descongelar en hielo una alícuota de células electrocompetentes y mezclar con una cantidad adecuada (2,5-5 ng) de vector. Dispense la mezcla en una cubeta de 0,1 cm apta para electroporación y aplique 1,8 kV.
4. Transfiera inmediatamente las células electroporadas a 1 ml de caldo súper óptimo con medio de represión de catabolitos (SOC) (medio LB suplementado con glucosa al 0,2% p/v, cloruro de magnesio 10 mM o MgCl₂, cloruro de potasio 2,5 mM o KCl), incube durante 1 hora bajo agitación y finalmente transfiera 100 μl de alícuotas a placas de Petri que contengan agar LB con el antibiótico adecuado. Incubar durante la noche (O/N) a 37 °C.
5. Purifica los transformadores rayando colonias individuales en placas de Petri.
6. Prepare las celdas electrocompetentes de los transformadores primarios y repita los pasos 1.1 a 1.5 para transformar con más plásmidos.
7. Preparar las existencias de glicerol de los cotransformadores. Transfiera una sola colonia en LB suplementada con los antibióticos apropiados, incube a 37 ° C bajo agitación y en fase logarítmica (0,6 O.D.), centrifugue la suspensión celular a 5.000 x g durante 20 min. Vuelva a suspender el gránulo en un medio antibiótico LB que contenga un 15% v/v de glicerol. Dispense en alícuotas y almacene a -80 °C.

2. Análisis de mutaciones de poblaciones que coexpresan la subunidad ε de tipo salvaje de la ADN polimerasa III de E. coli y la variante mutagénica εD12A

1. Transfiera una sola colonia de E. coli TOP10 que contenga los vectores pBAD-ε y pGOOD1-εD12A a 1 ml de medio antibiótico LB. Incubar O/N a 37 °C.
2. Diluir el precultivo 1:250 en 3 matraces que contengan medio fresco (10 ml), añadir los inductores apropiados (arabinosa, isopropilo β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG), o arabinosa e IPTG, 1 mM cada uno), e incubar a 37 °C durante 8 horas. Preparar en paralelo cultivos no inducidos.
3. Recoger alícuotas de 1 ml, luego diluir 1:500 en matraces nuevos que contengan medio fresco (10 ml) suplementado o no con los inductores adecuados. Incubar O/N a 37 °C.
4. Repita los pasos 2.2 y 2.3 y recoja alícuotas de 1 ml.
5. Determine el número de generaciones que se produjeron en cada referencia cultural. Transfiera en placas LB, 100 μl de diluciones seriadas apropiadas de inóculo y cultivo. Incubar O/N a 37 °C. Contar las colonias en las placas LB y calcular el logaritmo del número de células presentes en el inóculo (log_I) y en el cultivo al final del crecimiento (log_C). Para determinar el número de generaciones, use la fórmula: (log_C– log_I)/0.301.
6. Centrifugar a 5.000 x g durante 20 min y resuspender las células en 1 ml de clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl) de 50 mM, pH 7,6, 50 mM de NaCl. Para permeabilizar las células, agregue 2-3 gotas de cloroformo y vórtice durante 20 segundos.
7. Determine la actividad β-glucosidasa de cada alícuota en una microplaca de 96 pocillos, utilizando p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (PNPGluc) como sustrato. Añadir a cada pocillo 100 μl de células permeabilizadas y 100 μl de sustrato (16 mg/ml de solución madre en agua o H₂O). Tenga cuidado de evitar burbujas de aire en los pozos. Lea la absorbancia a 420 nm, utilizando un lector de microplacas y el filtro adecuado.

Materials