Extracción y purificación de plastoglóbulos de bacterias fotosintéticas

Resumen

Fuente: Shivaiah, K., et al. Aislamiento de gotas de lípidos de plastoglóbulos del tejido foliar de la planta y cianobacterias. J. Vis. Exp. (2022)

El video demuestra el aislamiento de plastoglóbulos de cianobacterias. Comienza con un cultivo de cianobacterias y continúa a través de la disrupción celular utilizando fuerza mecánica. La liberación de pigmentos fotosintéticos indica una lisis exitosa. Luego se usa un gradiente escalonado de sacarosa para separar los componentes celulares por densidad, lo que permite que los plastoglóbulos de baja densidad formen una banda distinta en la parte superior. Esta fracción se recolecta y conserva para su posterior análisis.

Protocolo

1. Aislamiento de plastoglóbulos crudos

1. Extracción de plastoglóbulos crudos de cianobacterias
   1. Cultive un cultivo de 50 ml de Synechocystis sp. PCC 6803 a la fase estacionaria (aproximadamente 7-10 días) y ajuste la densidad celular a una densidad óptica a 750 nm (OD₇₅₀) de 2.0 usando un espectrofotómetro. Para condiciones de cultivo, use medios BG-11 y cultive en una incubadora a una intensidad de luz de 150 μmol fotones / m² / s, 2% de CO₂, 32 ° C y con agitación continua a 150 revoluciones por minuto (rpm).
   2. Para eliminar los polisacáridos, lave las células centrifugando el cultivo de 50 ml a 6.000 × g durante 45 min a 4 °C y posteriormente eliminando el sobrenadante. Continúe lavando las células dos veces en 50 ml de tampón A (Tabla 1). Retire una alícuota del homogeneizado celular y déjela a un lado antes de la centrifugación para almacenarla como una muestra celular total representativa
   3. Vuelva a suspender el gránulo lavado en 25 ml de tampón A y rompa las células usando una celda de presión francesa a 1,100 libras por pulgada cuadrada (psi), repitiendo el proceso 3× (coloque la muestra en hielo entre cada ciclo para evitar la desnaturalización de proteínas) hasta que el color lisado cambie de verde a rojo-azul-verde bajo luz blanca. Utilice una celda preenfriada y realice este paso en la cámara frigorífica.
   4. Distribuya el homogeneizado resultante entre ocho tubos de ultracentrífuga de 3 ml llenos hasta un máximo de 2,5 ml en cada tubo y luego superponga cuidadosamente con 400 μl de R medio, produciendo un gradiente escalonado.
   5. Equilibre cuidadosamente los tubos añadiendo medio R adicional, según sea necesario, y centrifugue durante 30 min a 150.000 × g a 4 °C. El tilacoide y otros orgánulos más pesados (incluidos los cuerpos de polihidroxialcanoato) se sedimentarán, mientras que los plastoglóbulos se verán fácilmente como una almohadilla amarilla y aceitosa en o cerca de la parte superior del gradiente de sacarosa (Figura 1C).
   6. Coseche la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos con una jeringa y una aguja de 22G y deposite en un tubo de 2 ml. Raspe los plastoglóbulos del costado de la pared del tubo de ultracentrífuga con la punta de la aguja si es necesario.
   7. Continúe con el paso 2.2. Alternativamente, almacene los plastoglóbulos crudos a -80 ° C y purfíquelos más tarde.

Tabla 1: Recetas de tampón para el aislamiento de plastoglóbulos del tejido foliar de la planta o cianobacterias.

Composiciones de tampón a
Tampón de molienda	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM de cloruro de magnesio (MgCl2)
	100 mM de sorbitol
	5 mM de ácido ascórbico b
	5 mM de cisteína reducida b
	0,05 % (p/v) Albúmina sérica bovina (BSA) b
R medio	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
Medio R 0.2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,2 M de sacarosa
Medio R 0.7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,7 M de sacarosa
Tampón A	25 mM HEPES-KOH (pH 7,8)
	250 mM de sacarosa
un. Se proporcionan las concentraciones finales de cada componente tampón.
b. Debe agregarse fresco el día del aislamiento. Si bien los tampones se pueden preparar el día antes del aislamiento, ciertos ingredientes deben agregarse frescos el día del aislamiento, así como cualquier inhibidor de la fosfatasa y la proteasa.

2. Cosecha de plastoglóbulos puros

1. Procesamiento de cianobacterias
   1. Produzca un gradiente de sacarosa en cuatro tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml, en capas primero con 500 μl de los plastoglóbulos crudos del paso 1.3 mezclados con 750 μl de medio R 0,7, luego superponga con 750 μl de medio R 0,2.
   2. Centrifugar el gradiente de sacarosa a 150.000 × g durante 90 min a 4 °C. Recoger los plastoglóbulos puros (Figura 1C) con una jeringa y una aguja de 22 G de la fase superior del gradiente de sacarosa y transferirlos a un tubo de 1,5 ml.
   3. Alícuota de los plastoglóbulos puros y congelación instantánea en nitrógeno líquido. Almacenar directamente a -80 °C o liofilizar hasta obtener un polvo seco.

Resultados

Figura 1: Aislamiento e inmunotransferencia de plastoglóbulos y tilacoides. (A) Una muestra representativa de plastoglóbulos purificados de Z. mays antes de la extracción del gradiente de sacarosa. (B...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ascorbato	BDH	BDH9242
Albúmina de suero bovino	Proliant Biológico	68700
Celda de presión francesa (modelo FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Cloruro de magnesio	Sigma Aldrich	M8266
Incubadora de agitación Multitron	Infors HT	N/A
Hidróxido de potasio	Fisher Chemicals	M16050
Cisteína reducida	MP Bioquímicos	101444
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sacarosa	Sigma Aldrich	S9378
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Ultracentrífuga Optima MAX-TL	Beckman Coulter	Referencia A95761