Purificación por gradiente de densidad de plastoglóbulos cianobacterianos

Resumen

Fuente: Shivaiah, K., et al. Aislamiento de gotas de lípidos de plastoglóbulos del tejido foliar de la planta y cianobacterias. J. Vis. Exp. (2022).

Este video demuestra el aislamiento de plastoglóbulos de cianobacterias mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, destacando su naturaleza rica en lípidos y baja densidad y asegurando su preservación estructural para el análisis posterior.

Protocolo

1. Cosecha de plastoglóbulos puros

1. Procesamiento de cianobacterias
   1. Producir un gradiente de sacarosa en cuatro tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml en capas primero con 500 μL de los plastoglóbulos crudos del paso 1.3 mezclados con 750 μL de medio R 0,7, luego superponer con 750 μL de medio R 0,2 (Tabla 1)
   2. Centrifugar el gradiente de sacarosa a 150.000 x g durante 90 min a 4 °C. Recoger los plastoglóbulos puros (Figura 1C) con una jeringa y una aguja de 22 G de la fase superior del gradiente de sacarosa y transferirlos a un tubo de 1,5 ml.
   3. Alícuota de los plastoglóbulos puros y congelación instantánea en nitrógeno líquido. Almacenar directamente a -80 °C o liofilizar hasta obtener un polvo seco.

Tabla 1: Recetas de tampón para el aislamiento de plastoglóbulos de cianobacterias.

R medio	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
Medio R 0.2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,2 M de sacarosa
Medio R 0.7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,7 M de sacarosa

Resultados

Figura 1: Aislamiento e inmunotransferencia de plastoglóbulos y tilacoides. (A) Una muestra representativa de plastoglóbulos purificados de Z. mays antes de la extracción del gradiente de sacarosa. (B...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Cloruro de magnesio	Sigma Aldrich	M8266
Sacarosa	Sigma Aldrich	S9378
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Ultracentrífuga Optima MAX-TL	Beckman Coulter	Referencia A95761