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1. Alimentar gusanos con bacterias vivas en cultivo líquido
NOTA: Este protocolo se utiliza para colonizar gusanos con bacterias cultivadas en laboratorio en condiciones bien mezcladas en cultivo líquido. Los gusanos pueden colonizarse con aislados individuales de cultivo puro (p. ej., patógenos como Enterococcus faecium) o mezclas de aislados (p. ej., comunidades mínimas de microbioma).
- Comience con gusanos adultos sincronizados lavados con sacarosa en un tubo cónico de 15 ml. Lave los gusanos una vez en 12 ml de tampón S y deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender los gusanos lavados en el volumen de medio S necesario para el experimento. Considere el volumen de condiciones experimentales, el número de condiciones en las que se dividirán los gusanos y las concentraciones finales de gusanos y bacterias.
NOTA: La alimentación de los gusanos varía según la disponibilidad bacteriana y los gusanos pueden estresarse por el hacinamiento. Para la colonización en cultivo líquido, se recomiendan <1000 gusanos/mL y >107 UFC/mL; 1011 UFC/ml se considera densidad de alimentación "ad libitum" en E. coli. - Centrifugar cultivos bacterianos. Vierta el sobrenadante; La aspiración o el pipeteo se pueden utilizar para eliminar el sobrenadante de las bacterias que forman gránulos sueltos.
NOTA: Para cultivos >5 ml, transfiéralos a tubos de 15 ml y centrifugue a ~ 2800 x g en una centrífuga de mesa grande durante 8-10 minutos. Los cultivos <5 ml se pueden transferir a tubos de 1,5 ml y centrifugar a 9000 x g durante 1-2 min en una pequeña centrífuga de mesa. Es posible que las bacterias altamente móviles (por ejemplo, muchas especies de Pseudomonas) deban enfriarse a 4 ° C durante 10-15 min para facilitar la formación de un gránulo estable, y puede ser mejor centrifugar a 4 ° C. - Vuelva a suspender los cultivos bacterianos en un volumen de tampón S y centrifugar nuevamente en pellets. Retire y deseche el sobrenadante como antes.
- Vuelva a suspender los cultivos bacterianos en medio S a la densidad deseada para el experimento, más cualquier antibiótico para la selección. Los antibióticos a utilizar, si los hubiera, dependerán del perfil de resistencia de las bacterias utilizadas para la colonización.
- Usando una punta de pipeta recubierta con tampón de gusano M9 suplementado con Triton X-100 al 0,01% (M9TX-01), los gusanos de pipeta suben y bajan suavemente hasta que los gusanos se resuspenden completamente en medio S, luego se transfieren a tubos o pocillos de placas para la colonización bacteriana.
- Agregue suspensión bacteriana a cada cultivo de lombrices para alcanzar la concentración bacteriana deseada y el volumen final.
- Si usa una placa de pocillos múltiples para la colonización, cubra la placa con una membrana de sellado estéril permeable al gas de 96 pocillos.
- Incubar agitando a 200 RPM para evitar que las bacterias se asienten durante la incubación.
2. Interrupción mecánica de gusanos individuales en un formato de 96 pocillos
NOTA: Esta sección describe un protocolo de formato de placa de 96 pocillos para la interrupción mecánica de C. elegans individuales colonizados por bacterias. Los primeros pasos del protocolo describen un método para purgar las bacterias no adheridas del intestino del gusano y limpiar el exterior de los gusanos mediante parálisis por frío y blanqueamiento de superficies. Estos pasos producirán gusanos adultos limpios y vivos que pueden interrumpirse mecánicamente para cuantificar el contenido bacteriano o usarse para experimentos adicionales. Este protocolo se puede adaptar para cuantificar bacterias en gusanos colonizados en cultivo líquido, en placas de agar o en suelo natural o de microcosmos.
- Coloque una alícuota de M9TX-01 en hielo para enfriar (4-5 veces el número de muestras en ml).
- Preparar una alícuota de M9TX-01 + lejía (hipoclorito de sodio al 6%, 1:1000 o 1:2000 v/v, 1 mL por muestra + 1 mL extra) y colocar sobre hielo para que se enfríe.
- Vuelva a suspender cada muestra de gusano en 1 ml de M9TX-01 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Centrifugar los tubos brevemente (2-3 s) en una minicentrífuga de baja velocidad (2.000 x g) a 25 °C para granular adultos. Pipetea el sobrenadante y deséchalo, asegurándote de no alterar el gránulo del gusano.
- Usando centrifugación, enjuague los gusanos dos veces con 1 ml de M9TX-01, luego una vez con 1 ml de tampón de gusanos M9, para reducir las bacterias externas.
- Purgar las bacterias no adheridas del intestino del gusano.
- Vuelva a suspender cada muestra de gusanos en 1 ml de medio S + 2x OP50 muerto por calor en un tubo de cultivo.
- Incubar a 25 °C durante 20-30 min para permitir el paso de cualquier bacteria no adherida del intestino.
NOTA: Esto también purgará cualquier proteína fluorescente extracelular de la luz y permitirá una visualización más clara de las bacterias marcadas adheridas al epitelio intestinal, particularmente cuando se usan fluoróforos ácido-resistentes (por ejemplo, mCherry, dsRed).
- Blanquea la superficie de los gusanos para eliminar las bacterias externas.
- Enjuague los gusanos purgados dos veces con 1 ml de M9TX-01 frío y deseche el sobrenadante.
- Deje que los tubos se enfríen durante 10 minutos con hielo (preferiblemente) o a 4 °C. Esto paralizará a los gusanos y evitará la ingestión de lejía.
NOTA: Otros protocolos utilizan un agente de parálisis química como el levamisol; Este es un enfoque establecido que requiere la adición de un flujo de desechos peligrosos. - Agregue 1 ml de tampón de lombriz M9 helado + lejía sin perfume (hidróxido de sodio al 8,25%, 1:1000 o 1:2000 v/v) a cada tubo. Deje reposar los tubos sobre hielo (preferiblemente) o a 4 ° C durante al menos 10 minutos para matar las bacterias externas.
NOTA: No exceda la concentración de lejía de 1:1000. Incluso en gusanos paralizados, puede resultar en mortalidad. - Pipetee el tampón de lejía y deséchelo; Regrese los tubos al hielo para asegurarse de que los gusanos no reanuden el bombeo hasta que se elimine la lejía.
- Agregue 1 ml de M9TX-01 frío a cada tubo. Centrifugar durante ~5 s en una minicentrífuga (2.000 x g a 25 °C); Vuelva a colocar los tubos en hielo. Retire el sobrenadante y deséchelo.
- Repita este paso de enjuague con otro 1 ml de M9TX-01 frío, desechando la mayor cantidad posible de sobrenadante.