Interrupción mecánica de gusanos individuales para evaluar la variabilidad en las interacciones huésped-bacteria

Resumen

Fuente: Taylor, M. N. et al. Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones entre Caenorhabditis elegans y bacterias. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra la cuantificación de la variabilidad de la carga bacteriana intestinal en Caenorhabditis elegans individuales a través de la interrupción mecánica. Describe los pasos para la preparación de muestras, la interrupción mecánica, la dilución en serie y el recuento de colonias para evaluar las diferencias en la carga bacteriana intestinal entre gusanos individuales.

Protocolo

1. Separe los gusanos en una placa profunda de 96 pocillos con grano de carburo de silicio para la interrupción mecánica. Prepare la placa de disrupción de 96 pocillos de la siguiente manera.
   1. Obtenga una placa estéril de 96 pocillos profundos de 2 ml y una cubierta de placa de silicona de 96 pocillos a juego.
      NOTA: Es importante utilizar placas que sean compatibles con los adaptadores de 96 pocillos para el disruptor tisular. Las pequeñas diferencias en las dimensiones externas marcan la diferencia entre una placa que se puede quitar de los adaptadores y una que no.
   2. Con una espátula estéril, agregue una pequeña cantidad de carburo de silicio estéril de grano 36 a cada pocillo de la placa que recibirá un gusano. Use suficiente arena para cubrir apenas el fondo del pocillo (aproximadamente 0,2 g por pocillo). El exceso de material dificultará la llegada de una punta de pipeta al fondo del pocillo al recuperar el contenido.
   3. Agregue 180 μL de tampón de gusano M9 a cada pocillo.
   4. Etiquete las columnas o filas para indicar dónde irá cada muestra, luego cubra la placa sin apretar con la cubierta de placa de silicona de 96 pocillos.
2. Transfiera los gusanos individuales a la placa de 96 pocillos para su interrupción.
   1. Mueva los gusanos permeabilizados con cuidado a una placa de Petri pequeña (35 o 60 mm) que contenga suficiente tampón de gusano M9 suplementado con Triton X-100 (M9TX-01) al 0,01% para llenar el plato a una profundidad de ~1 cm.
      NOTA: Si hay una gran cantidad de gusanos, puede que no sea factible transferir toda la muestra, ya que el líquido se apiñará y será difícil pipetear gusanos individuales.
   2. Con un microscopio de disección u otro dispositivo de bajo aumento, pipetee gusanos individuales en volúmenes de 20 μL y transfiéralos a pocillos individuales de la placa de 96 pocillos.
      NOTA: Es mejor cosechar solo gusanos recién muertos. Evite los gusanos con una forma rígida y lineal, ya que estos gusanos pueden haber estado muertos durante algún tiempo. Trate de tomar gusanos que sean curvos o en forma de S, con fisiología macroscópica normal y un intestino intacto.
   3. Después de transferir cada volumen, asegúrese de que el gusano seleccionado haya sido expulsado al pozo. Para ello, pipetee 20 μl de M9TX-01 desde un área despejada de la placa de Petri y libere todo el volumen de nuevo en la placa; Esto normalmente expulsará el gusano si está pegado a la pipeta. Si el gusano se atascó, retire 20 μL del pocillo y vuelva a intentar la transferencia.
   4. Una vez que se hayan transferido todos los gusanos, cubra la placa de 96 pocillos con una hoja de película de sellado flexible con respaldo de papel disponible comercialmente (2 x 2 cuadrados), asegurándose de que el lado con respaldo de papel de la película de sellado esté hacia abajo sobre los pocillos de muestra. Tenga cuidado de no estirar demasiado la película de sellado, o será muy difícil de quitar más tarde.
   5. Coloque la estera de sellado de silicona ligeramente sobre la película de sellado flexible; No presione la tapa hacia abajo en los pocillos en este momento.
   6. Mover el plato a 4 °C para que se enfríe durante 30-60 min. Esto evitará el sobrecalentamiento durante la interrupción, lo que puede dañar las muestras.
      NOTA: Este es un punto de interrupción en el protocolo. En la mayoría de los casos, la placa se puede dejar a 4 ° C durante un máximo de 4 h antes de moler. No deje los gusanos durante la noche, ya que esto cambiará los recuentos bacterianos.
3. Cargue placas de 96 pocillos en un disruptor tisular para romper los tejidos de los gusanos y liberar las bacterias intestinales.
   NOTA: (Opcional) Si se utiliza un número impar de placas de 96 pocillos para digeridos, es necesario preparar un contrapeso antes de continuar. Use una placa profunda vacía de 96 pocillos y llene los pocillos con agua hasta que pese lo mismo que la primera placa.
   1. Presione la estera de sellado de silicona firmemente en los pocillos para crear un sello, asegurándose de que la tapa quede plana en toda la superficie de la placa.
      NOTA: Si la película de sellado flexible es demasiado gruesa después de estirarla, será difícil asegurar la tapa de silicona de manera que quede plana en todos los pocillos. Esto dará como resultado un sellado insuficiente y contaminación de pozo a pozo durante la agitación.
   2. Asegure las placas en el disruptor tisular con los adaptadores de placas de 96 pocillos. Agite las placas durante 1 minuto a 30 Hz, luego gire las placas 180° y agite nuevamente durante 1 minuto. Esto ayudará a garantizar una interrupción uniforme en todos los pocillos de la placa.
   3. Golpee las placas firmemente en el banco dos o tres veces para desalojar cualquier grano de la película de sellado flexible.
   4. Usando una centrífuga grande con dos adaptadores de placa de 96 pocillos, gire las placas hacia abajo a 2400 x g durante 2 minutos para reunir todo el material en el fondo de los pocillos.
   5. Retire la tapa de silicona y retire con cuidado la película de sellado flexible.
      NOTA: Si la película de sellado flexible se pega en alguno de los pocillos, utilice una punta de pipeta de 200 μl para retirarla. Esto es común cuando la película de sellado flexible se estira demasiado.
4. Diluir en serie muestras de digestión de gusanos en 300 μL en placas de 96 pocillos.
   1. Con una pipeta multipocillo ajustada a 200 μl, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces lenta y cuidadosamente para volver a mezclar el contenido de los pocillos y, a continuación, extraiga la mayor cantidad de líquido posible. Transfiera este líquido a las filas superiores de las placas de 96 pocillos preparadas para la dilución en serie de muestras de gusanos alteradas.
   2. Con una pipeta de 96 pocillos ajustada a 20 μl, retire este volumen de líquido de la fila superior y dispense en la fila B. Pipetee hacia arriba y hacia abajo 8-10 veces para mezclar. Deseche las propinas.
   3. Repita el paso 4.2, comenzando desde las muestras 0.1x en la fila B para crear muestras de dilución 0.01x en la fila C.
   4. Repita el paso 4.2 nuevamente, yendo de la fila C a la fila D.
   5. Coloque en agar sólido para la cuantificación bacteriana. Para gusanos monocolonizados, generalmente es suficiente colocar 10-20 μL de gotas de cada dilución [1x-0.001x] en placas de agar. Para la colonización de múltiples especies, coloque cada dilución en placas por separado pipeteando 100 μL en una placa de agar de 10 cm; Extienda inmediatamente con perlas de vidrio.

Materiales