Cuantificación de la polaridad y la dinámica de un componente del sistema de secreción en Legionella pneumophila

Abstract

Fuente: Chetrit, D., et al. Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de Legionella pneumophila Dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra el uso de imágenes de fluorescencia de células vivas para cuantificar la polaridad y la dinámica de los componentes del sistema de secreción en Legionella pneumophila, lo que permite el análisis del reclutamiento espacial y la redistribución citosólica crítica para comprender la patogénesis bacteriana

Protocol

1. Cuantificación de la localización polar y la dinámica de los componentes punto/ICM

NOTA: Los siguientes pasos están diseñados para imágenes con 0,129 μm por píxel que se adquirieron con binning de 2 x 2.

1. Cuantificación de polaridad para proteínas de fusión sfGFP (proteína fluorescente verde supercarpeta) (Figura 1)
   1. Ajuste el contraste de la imagen para que las bacterias sean claramente visibles. Utilice la herramienta de región para colocar un rectángulo de 0,25 x 1,3 μm² que comience en el polo y se extienda hacia el citoplasma. El rectángulo debe permanecer precisamente dentro de los bordes bacterianos.
   2. Marque al menos 200 bacterias y use el botón Región para enmascarar para crear máscaras para las regiones de interés. En Estadísticas de máscara y Ámbito de máscara, elija Objeto. A continuación, en Características e intensidad, marque Intensidad media y varianza.
   3. Exporte los datos y calcule las puntuaciones de polaridad de cada bacteria como la relación entre la varianza y la intensidad media.
   4. Para aplicaciones de alto rendimiento, utilice un objetivo de fase y una configuración de condensador adecuada para adquirir imágenes con los canales de fase y 488 nm. Asegúrese de elegir campos de visión donde las bacterias estén completamente separadas.
   5. Ajuste el contraste del canal de fase de la imagen a un nivel en el que las bacterias sean claramente visibles. Abra la imagen de doble canal, inicie la ventana Crear máscara de segmento y cambie el canal a fase.
   6. Ajuste un umbral adecuado y elimine objetos pequeños con el botón Definir objetos . En Perfeccionar máscara, elija Eliminar objetos de bordes y, posteriormente, separe las máscaras de bacterias adyacentes entre sí.
   7. Calcular las puntuaciones de polaridad de la señal en el canal 488 para cada celda como se describió anteriormente en los pasos 1.1.2–1.1.3.
2. Cuantificación de la dinámica de las proteínas de fusión sfGFP (Figura 2)
   NOTA: La dinámica se define como cambios en la intensidad a lo largo del tiempo, y los siguientes pasos están diseñados para períodos cortos de imágenes (es decir, varios minutos). Agregue a la almohadilla los suplementos apropiados si desea períodos de imagen más largos.
   1. En la ventana Captura de imagen , marque Timelapse, introduzca el tiempo de los intervalos en el cuadro de intervalo e introduzca 2 en el cuadro # de puntos de tiempo . Adquiera dos imágenes sucesivas de Legionella pneumophila expresando la proteína fluorescente de interés.
   2. Ajuste el contraste de la imagen hasta que las celdas sean claramente visibles. Siga la Figura 2A y las descripciones a continuación para colocar tres máscaras diferentes. Utilice la herramienta de región para colocar un cuadrado de 0,25 x 0,25 μm en el centro de al menos 400 celdas.
   3. Utilice el botón Región para enmascarar para crear una máscara (máscara 1) de los cuadrados de interés. Cree una nueva máscara vacía (máscara 2) y use la herramienta de píxeles o la herramienta de polígono para marcar toda el área de celda de al menos 25 celdas aleatorias, que se utilizarán para calcular el blanqueo de fluorescencia. Crea una nueva máscara vacía (máscara 3) y usa la herramienta de pincel grande para marcar áreas entre las celdas, que se usarán para la resta de fondo.
   4. En Estadísticas de máscara y ámbito de máscara, elija Objeto para máscara 1 y máscara 2. A continuación, en Características e intensidad, elija Intensidad media y exporte los datos de las dos máscaras. Para la máscara 3, exporte la intensidad media de toda la máscara.
   5. Calcule el cambio en la intensidad de fluorescencia para cada objeto en la máscara 1 usando las siguientes fórmulas:

donde la máscara 1 es un cuadrado de 0,25 μm × 0,25 μm colocado en el centro de la celda, la máscara 2 cubre toda la célula, la máscara 3 es el fondo entre las células, t1 es la intensidad media en el primer punto de tiempo y t2 es la intensidad media en el segundo punto de tiempo.

Results

Figura 1: Cuantificación de la localización polar de las subunidades del sistema Dot/ICM. (A) La visualización en tiempo real de DotB-sfGFP expresada en Lp01 mostró localización polar. DotB-sfGFP mostró un patrón difu...

Materials