Preparación de Legionella pneumophila para tomografía electrónica criogénica

Abstract

Fuente: Chetrit, D., et al. Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de Legionella pneumophila Dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020)

El video describe cómo preparar muestras de Legionella pneumophila para tomografía crioelectrónica combinando cultivo bacteriano, marcado de nanopartículas de oro y técnicas de vitrificación. El proceso preserva las estructuras celulares nativas y permite obtener imágenes de alta resolución de los componentes del sistema de secreción asociados a la membrana.

Protocol

1. Detección de la densidad de masa de sfGFP con crio-ET

1. Preparación de muestras, recopilación de datos y reconstrucción

1. Hacer crecer un parche pesado de Legionella pneumophila que exprese una proteína Dot/Icm etiquetada con fluorescencia en placas de CYE-agar-estreptomicina durante 48 horas a 37 °C. Resuspender las células en ddH₂O a un OD₆₀₀ de 0,7. Agregue 5 μL de partículas de oro coloidal (BSA Tracer, 10 nm) a 20 μL de la suspensión celular.

2. Pipetear 5 μL de la mezcla celular en una rejilla de carbono agujereada recién descargada (R 2/....

Materials