Preparación de Legionella pneumophila para tomografía electrónica criogénica

Resumen

Fuente: Chetrit, D., et al. Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de Legionella pneumophila Dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020)

El video describe cómo preparar muestras de Legionella pneumophila para tomografía crioelectrónica combinando cultivo bacteriano, marcado de nanopartículas de oro y técnicas de vitrificación. El proceso preserva las estructuras celulares nativas y permite obtener imágenes de alta resolución de los componentes del sistema de secreción asociados a la membrana.

Protocolo

1. Detección de la densidad de masa de sfGFP con crio-ET

1. Preparación de muestras, recopilación de datos y reconstrucción

1. Hacer crecer un parche pesado de Legionella pneumophila que exprese una proteína Dot/Icm etiquetada con fluorescencia en placas de CYE-agar-estreptomicina durante 48 horas a 37 °C. Resuspender las células en ddH₂O a un OD₆₀₀ de 0,7. Agregue 5 μL de partículas de oro coloidal (BSA Tracer, 10 nm) a 20 μL de la suspensión celular.

2. Pipetear 5 μL de la mezcla celular en una rejilla de carbono agujereada recién descargada (R 2/1 en malla Cu 200) y dejar reposar durante 1 min. Seque con papel de filtro y congele en etano líquido usando un aparato de émbolo accionado por gravedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Partículas de oro coloidal de 10 nm	Aurion	25486
100x Objetivo Plan Apo (1.4 NA)	Nikon
ASES	Sigma-Aldrich	Referencia A9758
Cámara digital monocromática CoolSNAP EZ 20 MHz	Fotometría
Marco genético, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Scientific	AB-0578
Malla Holey Carbon Grid R 2/1 Cu 200	Quantifoil	Pregunta 225-CR1
Nitrato de hierro (III) no hidratado	Sigma-Aldrich	216828
Cámara K2 Summit para crio-EM	GATAN
Portaobjetos de cubierta de microscopio 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Portaobjetos de cubierta de microscopio 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Portaobjetos de microscopio 25x75x1 mm	Globo científico	1380
Libro de diapositivas 6.0	Innovaciones en imágenes inteligentes
Motor de luz Spectra X	Lumencor