Cultivo de la bacteria Vibrio natriegens de rápido crecimiento

Resumen

Fuente: Wiegand, D. J., Lee, et al., Expresión de proteínas libres de células utilizando la bacteria de rápido crecimiento Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra el cultivo y la cosecha de Vibrio natriegens, una bacteria de rápido crecimiento, en condiciones aireadas para preparar gránulos bacterianos para la generación de extracto crudo.

Protocolo

Preparación de Extracto de Células Crudas de Vibrio natriegens: Cultivo Bacteriano

1. Preparar el medio de crecimiento bacteriano de V. natriegens LB-V2 (caldo de lisogenia con sales V2) según la Tabla 1. Esterilice los medios de cultivo en autoclave. Deje que el medio alcance la temperatura ambiente (RT). Almacene el exceso de medios en RT.
   CAUTELA: Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado y consulte las instrucciones específicas del laboratorio cuando opere un autoclave.
2. Use una reserva de glicerol de V. natriegens de tipo salvaje para inocular 3 ml de medios LB-V2. Cultiva durante la noche a 30 °C mientras agitas a 225 rpm.
3. Lave 1 ml del cultivo durante la noche centrifugando a 10.600 x g en una centrífuga de sobremesa durante 1 min. Aspire el sobrenadante sin alterar el sedimento resultante y vuelva a suspender en 1 ml de medio LB-V2 fresco.
4. En un matraz Erlenmeyer deflector de 4 L esterilizado en autoclave con tapa estéril, agregue 1 L de medios de crecimiento LB-V2 frescos. Inocular utilizando 1 mL de cultivo lavado durante la noche (proporción de dilución 1:1.000). Cultiva a 30 °C agitando a 225 rpm.
   NOTA: Los cultivos de V. natriegens se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo manteniendo la proporción de dilución de 1:1,000. Por ejemplo, agregue 250 μL de cultivo lavado durante la noche a 250 mL de medios de crecimiento LB-V2 frescos en un matraz Erlenmeyer deflector de 2 L con una cubierta estéril.
5. Monitoree el OD₆₀₀ del cultivo usando un espectrofotómetro. Cuando el cultivo alcance OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, coseche el cultivo mediante centrifugación a 3.500 x g durante 20 min a 4 °C. Coloque el pellet sobre hielo.
   NOTA: V. natriegens crece rápidamente, por lo que es necesario un estrecho seguimiento del cultivo. El crecimiento a OD₆₀₀ = 1.0 debería tomar aproximadamente 1.5−2 h en la relación de dilución de 1: 1,000.
6. Aspire el sobrenadante y almacene inmediatamente el sedimento bacteriano resultante a -80 °C o proceda directamente a la lisis celular.
   NOTA: Este paso es un buen punto de parada; sin embargo, se recomienda que el gránulo se procese inmediatamente o dentro de 1 a 2 días para obtener mejores resultados.

Tabla 1: Reactivos para la preparación de 1 L de medios de crecimiento bacteriano LB-V2

Cuadro 1 A	Preparación de medios de crecimiento bacteriano LB-V2
Componente	Cantidad (g)	Concentración final (mM)	Volumen final (L)
Caldo LB (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Cuadro 1 B	Preparación del tampón de lisis S30A
Componente	Cantidad (g)	Concentración final (mM)	Volumen final (L)
Solución de Tris (pH 8.0) - 1 M (mL)	25	50	0.5
Mg-glutamato	2.72	14
K-glutamato	6.10	60
Ditiotreitol (DTT) - 1 M (mL)	1	2

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de 2 ml	Eppendorf	22363352
HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico)	Sigma	H3375
LB (Luria-Bertani) Caldo (Miller)	Sigma	L3522
Cloruro de magnesio (MgCl₂)	Sigma	M8266
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma	P9333
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma	S7653
Solución de Tris (pH 8.0) - 1 M	Invitrogen	AM9856
Vibrio natriegens (tipo salvaje) Stock liofilizado	ATCC	14048