Preparación de extracto celular crudo de Vibrio natriegens

Resumen

Fuente: Wiegand, D. J., et al. Expresión de proteínas libres de células utilizando la bacteria de rápido crecimiento Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra la preparación de un extracto celular de Vibrio natriegens, una bacteria de rápido crecimiento conocida por su alta tasa de síntesis de proteínas. El gránulo bacteriano se lava y se vuelve a suspender en tampón de lisis antes de la sonicación en hielo para evitar la degradación celular. El lisado se centrifuga para separar los restos celulares insolubles, y el extracto celular se recolecta, se congela rápidamente y se almacena para uso futuro.

Protocolo

1. Preparación de extractos de células crudas de V. natriegens – Cultivo bacteriano

1. Prepare los medios de crecimiento bacteriano de V. natriegens , caldo de lisogenia versión 2 (LB-V2) según la Tabla 1. Esterilice los medios de cultivo en autoclave. Deje que el medio alcance la temperatura ambiente (RT). Almacene el exceso de medios en RT.
   CAUTELA: Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado y consulte las instrucciones específicas del laboratorio cuando opere un autoclave.
2. Use una reserva de glicerol de V. natriegens de tipo salvaje para inocular 3 ml de medios LB-V2. Cultiva durante la noche a 30 °C mientras agitas a 225 rpm.
3. Lave 1 ml del cultivo durante la noche centrifugando a 10.600 x g en una centrífuga de sobremesa durante 1 min. Aspire el sobrenadante sin alterar el sedimento resultante y vuelva a suspender en 1 ml de medio LB-V2 fresco.
4. En un matraz Erlenmeyer deflector de 4 L esterilizado en autoclave con una cubierta estéril, agregue 1 L de medios de crecimiento LB-V2 frescos. Inocular utilizando 1 mL de cultivo lavado durante la noche (proporción de dilución 1:1.000). Cultiva a 30 °C agitando a 225 rpm.
   NOTA: Los cultivos de V. natriegens se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo manteniendo la proporción de dilución de 1:1,000. Por ejemplo, agregue 250 μL de cultivo lavado durante la noche a 250 mL de medios de crecimiento LB-V2 frescos en un matraz Erlenmeyer deflector de 2 L con una cubierta estéril.
5. Monitoree el OD₆₀₀ del cultivo usando un espectrofotómetro. Cuando el cultivo alcance OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, coseche el cultivo mediante centrifugación a 3.500 x g durante 20 min a 4 °C. Coloque el pellet sobre hielo.
   NOTA: V. natriegens crece rápidamente, por lo que es necesario un estrecho seguimiento del cultivo. El crecimiento a OD₆₀₀ = 1.0 debería tomar aproximadamente 1.5−2 h en la relación de dilución de 1: 1,000.
6. Aspirar el sobrenadante y almacenar inmediatamente el sedimento bacteriano resultante a -80 °C o proceder directamente a la lisis celular descrita en la sección 2.
   NOTA: Este paso es un buen punto de parada; sin embargo, se recomienda que el gránulo se procese inmediatamente o dentro de 1 a 2 días para obtener mejores resultados.

2. Preparación de extractos celulares crudos de V. natriegens – lisis celular

1. Prepare el tampón de lisis S30 según la Tabla 1 en agua desionizada estéril (DI) y ajuste el pH a 7,7 con ácido acético glacial.
   CAUTELA: El ácido acético glacial debe manipularse con el EPP adecuado al ajustar el pH.
2. Enfríe el tampón de lisis S30 a aproximadamente 4 °C en un refrigerador o con hielo antes de comenzar el procedimiento de lisis celular.
   NOTA: Para un enfriamiento rápido, el tampón de lisis se puede colocar a -20 °C. No permita que el tampón se congele.
3. Coloque los gránulos de células en hielo durante 10 a 20 minutos o hasta que estén completamente descongelados. Vuelva a suspender todos los gránulos resultantes del mismo cultivo de 1 L utilizando 10 ml de tampón de lisis S30 frío, luego transfiera la suspensión a un tubo de 50 ml. Si los gránulos no se congelan en el congelador a -80 °C en el paso 1.6, proceda directamente a la resuspensión.
   NOTA: Aumente el volumen del tampón de lisis S30 utilizado para resuspender inicialmente los gránulos según sea necesario.
4. Centrifugar la suspensión a 3.500 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin alterar el sedimento. Lave el gránulo por segunda vez con 10 ml de tampón de lisis S30 frío. Coloque el gránulo en hielo.
5. En una cámara frigorífica, agregue 500 μL de tampón de lisis S30 frío al sedimento en el tubo de 50 ml. Con una punta de pipeta de gran diámetro, vuelva a suspender el gránulo y transfiera con cuidado toda la suspensión de gránulos a un tubo de 2 ml.
   NOTA: Si no se dispone de una pipeta de gran diámetro, utilice un par de tijeras para cortar el extremo de una punta de pipeta de 1 ml para aumentar el orificio para la transferencia de pellets.
   1. Transfiera la mayor cantidad de pellets posible sin aumentar significativamente el volumen; sin embargo, el pellet debe resuspenderse en suficiente líquido para ser sonicado, como lo indica una suspensión homogénea en el tubo de 2 ml. No llene demasiado el tubo de 2 ml. La suspensión no debe exceder los 1,5 ml; dividir en varios tubos si es necesario.
6. Mantenga el gránulo celular en hielo y trabaje en una cámara frigorífica. Llene un vaso de precipitados de 600 ml con hielo y coloque un soporte para tubos de 2 ml encima del hielo.
   NOTA: Es útil colocar el soporte del tubo cerca del costado del vaso de precipitados, de modo que la suspensión de pellets sea visible en el hielo para controlar el progreso de la sonicación (ver Figura 1).
7. Aplique un gránulo suspendido en un tubo de 2 ml brevemente para homogeneizar las células, mueva los tubos para eliminar las células de la parte inferior de la tapa y colóquelo en el soporte del tubo con la tapa abierta. Baje la punta del sonicador en la suspensión para que quede justo debajo de la superficie del líquido.
8. Prepare la configuración de sonicación como se muestra en la Figura 2 utilizando un sonicador y una sonda con un diámetro de punta de 1/8 de pulgada. Introduzca los siguientes ajustes en el control del sonicador: frecuencia de 20 kHz y amplitud del 50%, tiempo de encendido del pulso: 10 s, tiempo de apagado del pulso: 60 s.
9. Ejecute el protocolo de sonicación de pulsos durante tres ciclos. Si el volumen total de la suspensión de pellets es de > 500 μL, ejecute el protocolo de sonicación por pulsos seis veces.
   NOTA: Generalmente, 3-6 pulsos son suficientes para lisar gránulos de V. natriegens ; Es posible que se requieran pulsos adicionales dependiendo del sonicador. Durante la sonicación, utilice la plataforma de la perilla de ajuste para mover la sonda hacia arriba y hacia abajo para lisar cualquier sedimento que pueda haberse depositado en el fondo del tubo. El tubo se puede quitar del soporte y se puede agitar brevemente para volver a homogeneizar la suspensión entre pulsos.
   CAUTELA: Use protección auditiva adecuada cuando el sonicador esté activo.
10. Después de la sonicación, centrifugar el extracto celular crudo a 16.000 x g durante 30-45 min a 4 °C o hasta que el lisado esté libre de restos celulares, como se muestra en la Figura 3.
11. En una cámara frigorífica, alícuotas de 50 μl de los sobrenadantes resultantes en nuevos tubos de 2 ml sin alterar el sedimento.
    NOTA: Cualquier residuo que se transfiera accidentalmente a los nuevos tubos de 2 ml reducirá drásticamente la capacidad del extracto para la síntesis de proteínas de alto rendimiento.
12. Congele rápidamente los extractos de células crudas colocando tubos en un soporte de tubo con una cuerda de inmersión unida, como se muestra en la Figura 4. Sumerja los tubos en un Dewar que contenga nitrógeno líquido y colóquelos inmediatamente en un congelador a -80 °C hasta su uso. CAUTELA: Use el EPP adecuado para manipular nitrógeno líquido, incluida una bata de laboratorio, gafas de seguridad, un protector facial, un delantal criógeno y guantes.

Tabla 1: Reactivos para la preparación de 1 L de medios de crecimiento bacteriano LB-V2 y 0,5 L de tampón de lisis celular S30A.

Cuadro 1 A	Preparación de medios de crecimiento bacteriano LB-V2
Componente	Cantidad (g)	Concentración final (mM)	Volumen final (L)
Caldo LB (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Cuadro 1 B	Preparación del tampón de lisis S30A
Componente	Cantidad (g)	Concentración final (mM)	Volumen final (L)
Solución de Tris (pH 8.0) - 1 M (mL)*	25	50	0.5
Mg-glutamato	2.72	14
K-glutamato	6.10	60
Ditiotreitol (DTT) - 1 M (mL)*	1	2

Resultados

Figura 1: Un primer plano del vaso de precipitados y el soporte del tubo en la plataforma de sonicación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de 15 ml	Corning	352196
Tubos de 2 ml	Eppendorf	22363352
Tubos de 50 ml	Corning	352070
Frasco Dewar - 4L	ThermoScientific	10-194-100C
Ácido L-glutámico sal de hemimagnesio tetrahidratado	Sigma	49605
Ácido L-glutámico sal de potasio monohidrato	Sigma	G1149
Caldo LB (Miller)	Sigma	L3522
Cloruro de magnesio (MgCl₂)	Sigma	M8266
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma	P9333
Pellets de hidróxido de potasio	Sigma/Roche	1050121000
Sonicador Q125 y sonda CL-18	Qsonica	4422
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma	S7653
Vibrio natriegens (tipo salvaje) Stock liofilizado	ATCC	14048