Expresión de proteínas libres de células utilizando un extracto celular crudo bacteriano

Resumen

Fuente: Wiegand, D. J., et al. Expresión de proteínas libres de células utilizando la bacteria de rápido crecimiento Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra el uso de un sistema de expresión de proteínas libres de células bacterianas basado en lisado crudo de Vibrio natriegens para realizar transcripción y traducción in vitro acopladas. Destaca la preparación de una mezcla maestra con componentes esenciales y la síntesis paso a paso de proteínas funcionales a partir de una plantilla de ADN.

Protocolo

1. Preparación de componentes de reacción libres de células

1. Componentes de reacción general
   1. Preparar existencias de trabajo de Mg-glutamato y K-glutamato en tubos de 50 ml con agua DI (desionizada) estéril a concentraciones de 100 mM y 2000 mM, respectivamente.
   2. Prepare un material de trabajo de 50% (p/v) de polietilenglicol (PEG)-8000 agregando 100 ml de agua desionizada estéril a un vaso de precipitados de 250 ml. Coloque un pequeño agitador magnético en el vaso de precipitados. Pesar 50 g de PEG-8000 y añadir a los 100 ml de agua del vaso de precipitados.
   3. Coloque el vaso de precipitados en una placa de agitación calentada a 100 °C y revuelva a 250 rpm hasta que PEG-8000 esté en solución. Deje que la mezcla líquida PEG-8000 se enfríe antes de transferirla a tubos de 50 ml.
2. Combinación maestra de soluciones energéticas
   1. Prepare una solución de 5 M de KOH agregando 140 g de gránulos de KOH a 500 ml de agua desionizada estéril.
      CAUTELA: Prepare esta solución en una campana química y use EPP cuando manipule bases fuertes. La solución se calentará, por lo que la tapa de la botella debe estar suelta para evitar la acumulación de presión. Deje que la solución KOH alcance RT antes de usarla.
   2. Prepare un tampón HEPES-KOH de 1750 mM añadiendo 20,85 g de HEPES a un frasco de 100 ml. Agregue lentamente agua desionizada estéril hasta que el volumen alcance los 40 ml. Botella de vórtice para disolver el HEPES. Use la solución de KOH 5 M para ajustar el pH a 8.0 y luego lleve el volumen de la solución a 50 ml.
      CAUTELA: El KOH debe manipularse con el EPP adecuado al ajustar el pH.
   3. Prepare los 10 componentes restantes de la mezcla maestra de energía a las concentraciones indicadas en la Tabla 1 en agua desionizada estéril y coloque cada caldo en hielo. Descongele las existencias de 100 mM ATP, GTP, CTP y UTP a RT y colóquelas en hielo.
      NOTA: Se puede utilizar un termomezclador ajustado a 37 °C y 350 rpm para disolver los reactivos en la solución si es necesario. No sobrecaliente ni deje reactivos en el termomezclador durante un período prolongado de tiempo.
   4. En un tubo de 15 ml, agregue cada componente de la mezcla maestra de solución energética de acuerdo con el orden y el volumen especificados en la Tabla 1. Agite la solución después de agregar cada componente. Esto hará 5 ml de mezcla maestra de solución de energía 10x.
   5. Divida la mezcla maestra de solución energética 10x en alícuotas de 200 μL en tubos de 2 mL. Congele rápidamente cada alícuota. Colóquelos inmediatamente en el congelador a -80 °C hasta su uso.
3. Mezcla maestra de aminoácidos
   1. Para preparar una mezcla maestra fresca de aminoácidos 4x, comience descongelando cada caldo de aminoácidos a temperatura temperatura y luego colocándolo en hielo. Utilice un vórtice y/o un termomezclador a 37 °C y 350 rpm para asegurarse de que todas las reservas de aminoácidos se disuelvan por completo.
      NOTA: Es posible que la cisteína no se disuelva por completo; Se puede agregar a la mezcla maestra de aminoácidos como suspensión. No sobrecaliente ni deje reactivos en el termomezclador durante un período prolongado de tiempo.
   2. En un tubo de 15 ml, agregue el volumen apropiado de aminoácidos al agua desionizada estéril para que la concentración final de cada uno sea de 8 mM en el siguiente orden: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU y CYS. Después de agregar cada aminoácido, agite la solución de mezcla maestra. Los volúmenes enumerados en la Tabla 1 constituirán 2,4 ml de mezcla maestra de aminoácidos.
   3. Divida la mezcla maestra de aminoácidos 4x en alícuotas de 200 μL en tubos de 2 mL. Congele rápidamente cada alícuota. Colocar inmediatamente en el congelador a -80 °C hasta su uso.
4. Producción de plantilla de ADN plasmídico lista para reaccionar
   NOTA: La expresión de proteínas libres de células en este sistema se ha optimizado utilizando el vector de expresión de proteína fluorescente verde (GFP) T7-pJL1-sfGFP (Tabla de materiales). Se recomienda utilizar este plásmido como control de la eficiencia de la reacción libre de células y la columna vertebral de pJL1 para la clonación y expresión de otras secuencias de proteínas. Se pueden utilizar otras plantillas de ADN plasmídico; sin embargo, es importante tener en cuenta que la transcripción está controlada por una secuencia promotora T7 y la presencia de ARN polimerasa T7. A continuación se describe un protocolo simple para la producción a gran escala de cualquier plantilla de ADN plasmídico a partir de E. coli transformada.
   1. Purifique el vector deseado utilizando un kit de purificación de plásmidos según las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). NOTA: Se recomienda concentrar la plantilla de ADN plasmídico tanto como sea posible para cumplir con las estrictas restricciones de volumen de la reacción libre de células. En general, apunte a un material de trabajo de 750-1500 ng / μL.

2. Realización de reacciones de expresión de proteínas libres de células utilizando extracto crudo de V. natriegens

1. Expresión de proteínas libres de células mediante plásmido o plantilla de ADN lineal
   1. Retire la mezcla maestra de solución energética 10x y las alícuotas de mezcla maestra de aminoácidos 4x del congelador a -80 °C, descongele a temperatura temperatura ambiente y colóquelas en hielo. Retire las existencias de ARN polimerasa T7 e inhibidor de la ARNasa del congelador a -20 °C y colóquelas en hielo. Descongele la plantilla de ADN en RT y colóquela en hielo.
   2. Prepare una mezcla maestra de reacción libre de células según la Tabla 2 agregando cada componente en el siguiente orden a un tubo de 2 ml en hielo: mezcla maestra de aminoácidos, mezcla maestra de solución energética, Mg-glutamato, K-glutamato, plantilla de ADN, PEG-8000, ARN polimerasa T7 e inhibidor de ARNasa. Mueva suavemente el tubo después de cada adición a la mezcla maestra.
      NOTA: Si se va a utilizar una plantilla lineal para la expresión de proteínas libres de células, agregue 5-10 veces más material en comparación con la plantilla de plásmido para obtener rendimientos apreciables de proteínas.
   3. Retire el lisado celular crudo de V. natriegens de los congeladores a -80 °C y colóquelo en hielo durante 10-20 min hasta que se descongele. Agregue el volumen adecuado de extracto celular crudo a la mezcla maestra de reacción libre de células según la Tabla 2 y mezcle suavemente moviendo o pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   4. Expresión de proteínas libres de células de punto final mediante un termociclador
      1. Pipetee 10 μl de la mezcla maestra de reacción sin células en el fondo de una placa de PCR de 96 o 384 pocillos. Entre cada transferencia a la placa de PCR, mezcle la mezcla maestra moviendo suavemente el tubo.
         NOTA: La mezcla maestra de reacción libre de células debe mezclarse bien en todo momento para maximizar la reproducibilidad de la reacción y la expresión de proteínas libres de células en todas las muestras.
   5. Centrifugar brevemente la placa a 1.000 x g durante 10 s para agrupar cualquier mezcla maestra que pueda haberse atascado en los lados de los pocillos. Selle los pocillos con un adhesivo de placa para evitar la evaporación y luego coloque la placa de PCR en un termociclador a 26 °C con una tapa calentada a 105 °C.
      NOTA: La distribución uniforme del calor y la tapa calentada de un termociclador mejoran en gran medida los rendimientos de expresión de proteínas.
   6. Incubar las reacciones libres de células durante un mínimo de 3 h. Después de la incubación, las proteínas expresadas se pueden purificar, cuantificar y utilizar para procesos posteriores.
      NOTA: Las proteínas expresadas se pueden cuantificar directamente en la reacción libre de células utilizando un método de elección del usuario. Por ejemplo, las proteínas fluorescentes se pueden cuantificar utilizando una curva estándar externa, o la radiactividad se puede medir si se usa un aminoácido radiomarcado en la reacción libre de células. Por lo general, la espectroscopia UV-visible o los ensayos de proteínas totales no se recomiendan para medir directamente la producción de proteínas en reacciones libres de células sin una purificación inicial.

Tabla 1: Reactivos para la preparación de 5 ml de mezcla maestra de solución energética 10x y 2,4 ml de mezcla maestra de aminoácidos 4x.

Preparación de 10x Energy Solution Master Mix
Componente	Concentración de existencias (mM)	Concentración final (mM)	Cantidad (μL)	Volumen final (μL)
HEPES-KOH pH 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750.00
GTP	100	15	750.00
CTP	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
ARNt de E. coli MRE 600 (mg/ml)*	100	2	100.00
Hidrato de coenzima A	200	2.6	65.00
NAD	200	3.3	82.50
campamento	650	7.5	57.69
Ácido folínico	100	0.7	35.00
Espermidina	1600	10	31.25
3-PGA	2000	300	750.00
Agua desionizada estéril			49.99
	Preparación de 4x Mezcla Maestra de Aminoácidos
Componente	Concentración de existencias (mM)	Concentración final (mM)	Cantidad (μL)	Volumen final (μL)
ALA	168	8	114.3	2400
ARG	168	8	114.3
ASN	168	8	114.3
ÁSPID	168	8	114.3
Buena suerte	168	8	114.3
GLU	168	8	114.3
GLY	168	8	114.3
SUYOS	168	8	114.3
MENTIRA	168	8	114.3
LYS	168	8	114.3
CONOCIDO	168	8	114.3
PHE	168	8	114.3
PRO	168	8	114.3
SER	168	8	114.3
THR	168	8	114.3
VAL	168	8	114.3
TRP	168	8	114.3
TYR	168	8	114.3
LEU	140	8	137.1
CYS	168	8	114.3
Agua desionizada estéril			91.4

Tabla 2: Componentes de la mezcla maestra de reacción libre de células optimizada de V. natriegens para plantilla de ADN

Mezcla maestra de reacción sin células
Componente	Concentración de existencias (mM)	Concentración final (mM)	Cantidad (μL) 1x Reacción	Cantidad (μL) 50x Reacciones
Extracto (%)		25	2.50	125.00
Mg-glutamato	100	3.5	0.35	17.50
K-glutamato	2000	80	0.40	20.00
4x Mezcla Maestra de Aminoácidos	8.0	2	2.50	125.00
10x Mezcla Maestra de Soluciones Energéticas			1.00	50.00
ADN plasmídico (ng/μL)	1000	500	0.50	25.00
50% PEG-8000 (%)	50	2	0.40	20.00
ARN polimerasa T7			1.00	50.00
Inhibidor Murino de la ARNasa			0.10	5.00
Agua desionizada estéril			1.25	62.50
Volumen de reacción (μL):	10

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