Monitoreo en tiempo real del crecimiento bacteriano mediante un sistema de cultivo de microgotas microfluídicas

Resumen

Fuente: Jian, X. et. al., Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa mediante el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC). J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el uso de una plataforma basada en gotas microfluídicas para el monitoreo en tiempo real del crecimiento bacteriano. Al generar gotas uniformes que contienen suspensiones bacterianas y guiarlas a través de una vía de detección, el sistema permite la medición óptica continua de la densidad celular para construir una curva de crecimiento.

Protocolo

1. Preparativos

1. Conecte la aguja de la jeringa (el diámetro interior es de 0,41 mm y el diámetro exterior es de 0,71 mm), el conector rápido A y el frasco de reactivo (Figura 1C), y los esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min.
   NOTA: Desenrosque ligeramente la tapa de la botella de reactivo durante la esterilización. Se pueden preparar algunas botellas de reactivos más cada vez para su uso.
2. Utilice un filtro de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,22 μm para filtrar el aceite del sistema de cultivo de microgotas (MMC). Coloque el chip microfluídico (Figura 1B) y el aceite MMC en el banco limpio con anticipación y esterilícelos mediante irradiación ultravioleta durante 30 minutos antes de su uso.
   NOTA: Para obtener más información sobre el conector rápido A, el frasco de reactivos, el aceite MMC y el chip microfluídico, consulte la tabla de materiales.
3. Instalar el chip microfluídico
   1. Abra la puerta de la cámara de operaciones (Figura 1A) y levante la sonda de fibra óptica.
   2. Alinee los orificios del campo eléctrico con las agujas del campo eléctrico y coloque suavemente el chip en el pedestal del chip. Luego inserte las dos columnas de posicionamiento en los orificios de posicionamiento y coloque la sonda de fibra óptica (Figura 1D).
   3. Conecte el conector rápido A del chip al puerto correspondiente de la MMC según el número de posición (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Luego cierre la puerta de la cámara de operaciones.
4. Reponga el aceite MMC (hasta aproximadamente 80 ml) en la botella de aceite y vacíe el líquido residual en la botella de desechos antes de usarlo.
   NOTA: El líquido residual suele ser un residuo orgánico. Consulte la ley y la regulación regional al desechar, sujeto a cambios según la configuración experimental.

2. Medición de la curva de crecimiento en MMC

1. Preparación para la solución bacteriana inicial
   1. Siga las normas estándar relacionadas para preparar Luria-Bertani (LB) medio y autoclave a 121 ° C durante 15 min.
      NOTA: Componentes del medio LB: NaCl (10 g/L), extracto de levadura (5 g/L) y triptona (10 g/L).
   2. Sacar la cepa de Escherichia coli (E. coli) MG1655 del stock de glicerol y cultivarla en un matraz de agitación de 50 ml con 10 ml de medio LB en una incubadora agitadora (200 rpm) a 37 °C durante 5-8 h.
      NOTA: El tiempo de cultivo depende de las cepas específicas. Es óptimo cultivar la cepa en el período/fase logarítmica.
   3. Diluir la solución cultivada de E. coli MG1655 con medio fresco a una densidad óptica de 600 nanómetros (DO₆₀₀) de 0,05-0,1 para obtener una solución bacteriana inicial (preparar unos 10 ml).
2. Haga clic en Inicialización para inicializar la MMC. Después de que aparezca la interfaz de inicialización, establezca la temperatura de cultivo en 37 °C y el valor de la señal fotoeléctrica en 0,6 (Figura 2A). La inicialización tardará unos 20 minutos.
3. Encienda la lámpara ultravioleta (UV) (longitud de onda de 254 nm) durante la inicialización.
4. Inyecte la solución bacteriana inicial y el aceite MMC en el frasco de reactivos.
   1. Saque una botella de reactivo esterilizada en el banco limpio y apriete la tapa.
   2. Use una jeringa estéril de 10 ml para inyectar 3-5 ml de aceite MMC de la aguja de la jeringa del tubo lateral. Incline y gire la botella de reactivo lentamente para que el aceite se infiltre completamente en la pared interna.
   3. Inyecte aproximadamente 5 ml de solución bacteriana inicial y luego llene la botella de reactivo inyectando nuevamente 5-7 ml de aceite.
   4. Extraiga el conector rápido independiente A e inserte el conector rápido A de la botella de reactivo en su conector rápido B para completar la operación de inyección de muestras (Figura 3A).
5. Espere a que finalice la inicialización y luego apague la lámpara UV (longitud de onda 254 nm).
6. Abra la puerta de la cámara de operaciones y coloque la botella de reactivo en el baño de metal.
7. Extraiga el conector C2 del chip y el conector rápido A de la botella de reactivo. Conecte el conector del tubo lateral de la botella de reactivo al conector C2 y el conector del tubo superior al conector de O2. Luego cierre la puerta de la cámara de operaciones.
8. Haga clic en Curva de crecimiento para elegir la función de medición de la curva de crecimiento (Figura 2A). En la interfaz de configuración de parámetros, ingrese el número como 15, encienda el interruptor de detección OD y establezca la longitud de onda como 600 nm. Haga clic en Iniciar para iniciar la generación de gotas. Tardará unos 10 minutos. NOTA: Aquí, Número se refiere al número de gotas que se generarán. La longitud de onda se refiere a la longitud de onda de la OD que se va a detectar. Establezca el número (máximo 200) y la longitud de onda (350-800 nm) de acuerdo con los requisitos del experimento.
9. Cuando aparezca una ventana emergente en la interfaz principal que indique "Retire la botella de reactivo entre C2 y O2, luego haga clic en el botón Aceptar después de completar", abra la puerta de la cámara de operación para sacar la botella de reactivo y conecte los conectores C2 y O2.
10. Cierre la puerta y haga clic en el botón Aceptar en la ventana emergente para cultivar automáticamente las gotas y detectar los valores de OD.
    NOTA: La MMC detecta el valor de OD cuando la gota pasa por la sonda de fibra óptica. Por lo tanto, el período de detección depende del número de gotas generadas.
11. Cuando la curva de crecimiento alcance la fase estacionaria, haga clic en el botón Exportación de datos para exportar los datos OD. Seleccione la ruta de guardado de datos y exporte el valor de OD registrado durante el período de cultivo en el formato .csv, que se puede abrir con el software apropiado (por ejemplo, Microsoft Excel). Luego use un software de mapeo (por ejemplo, EXCEL y Origin 9.0) para trazar la curva de crecimiento.
    NOTA: Durante el proceso de cultivo, es factible hacer clic en la Exportación de datos en cualquier momento para exportar los datos de OD de todas las gotas actuales.

Resultados

Figura 1: Estructura y herramientas esenciales de MMC. (A) Cámara externa y operativa de MMC. (B) El chip microfluídico de MMC. El chip tiene siete canales (C1-C6 y CF). (C) Frasco de reactivo. Tiene un tubo superior y un tubo lateral. Antes de inyectar l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Membrana filtrante de PVDF de 0,22 μm	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Esterilizar el aceite MMC
Refrigerador de 4 °C	Haier	BCD-289BSW	Para el almacenamiento de reactivos
Agar-agar	Becton, Dickinson y compañía	214010	Para la preparación de placas sólidas
Banco limpio	Beijing Donglian Har Fabricación de instrumentos Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	Para funcionamiento aséptico y esterilización UV
Ordenador	Lenovo	E450	Instalación de software y control MMC
Incubadora de temperatura constante	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	Para el cultivo microbiano utilizando medio sólido
Balanza electrónica	OHAUS	AR 3130	Para el pesaje de reactivos
Tubo EP	Termo Fisher	1,5 ml	Para la recogida de gotas
Tubo de congelación	Termo Fisher	2,0 ml	Para la conservación de la cepa
Glicerol	REACTIVO GENERAL	G66258A	Para la conservación de la cepa
Olla de esterilización por vapor de alta presión	SANYO Eléctrico	MLS3020	Para esterilización en autoclave
Sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Realización de determinación de la curva de crecimiento y evolución adaptativa. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Chip microfluídico	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Para diversas operaciones de gotas. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Aceite MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	La fase oleosa para microfluidos de gotas. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
NaCl	REACTIVO GENERAL	G81793J	Componente del medio LB
Placa de Petri	Corning Incorporado	90 milímetros	Para la preparación de medio sólido
Pipeta	eppendorf	2,5 μl, 10 μl, 100 μl, 1000 μl	Para la manipulación de líquidos
Conector rápido A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	Para la conexión de cada junta. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Frasco de reactivo	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Muestreo y almacenamiento de solución y reactivos bacterianos. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Agitar el matraz	Unión-Biotecnología	50 ml	Para cultivo microbiano
Incubadora de agitación	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	Para el cultivo microbiano en matraz de batido
Jeringa	INSTRUCCIÓN MÉDICA JIANGSU ZHIYU CO., LTD	10 ml	Extraiga líquido e inyéctelo en la botella de reactivo
Aguja de jeringa	Ferretería OUBEL	22G	El diámetro interior es de 0,41 mm y el diámetro exterior es de 0,71 mm.
Triptona	Oxoid Ltd.	LP0042	Componente del medio LB
Refrigerador de temperatura ultrabaja	SANYO Ultra-bajo	MDF-U4086S	Para la conservación de la cepa (-80 °C)
Espectrofotómetro UV-Vis	Compañía General Electric	Ultrospec 3100 pro	Para la medición de valores de OD
Extracto de levadura	Oxoid Ltd.	LP0021	Componente del medio LB