Transformación natural y expresión de GFP en la cianobacteria filamentosa Phormidium lacuna

Resumen

Fuente: Weber, N., et al., Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la cianobacteria filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Este video describe un procedimiento para realizar una transformación natural en cianobacterias filamentosas utilizando ADN plasmídico para lograr una expresión estable de GFP y resistencia a los antibióticos a través de la recombinación homóloga.

Protocolo

1. Transformación natural y expresión de GFP

NOTA: La transformación se basa en un vector plásmido propagado en Escherichia coli (E. coli); pGEM-T o pUC19 pueden utilizarse como vectores troncales. En la sección de resultados representativos se describen ejemplos de vectores para la expresión de la proteína fluorescente verde de supercarpeta (sfGFP).

1. Realice todos los pasos utilizando material estéril en condiciones de laboratorio estériles (banco limpio, cristalería estéril).
2. Inocular 2 x 50 mL de medio líquido f/2 en dos matraces de 250 mL con 2 x 1 mL de filamentos de Phormidium lacuna (P. lacuna) de un cultivo continuo. Cultivar con luz blanca (50 μmol ^{m-2 s-1}) bajo agitación (rotación horizontal, 50 rpm) durante ~5 días a 25 °C.
3. Prepare ~ 200 μg del ADN del vector de transformación utilizando un kit de preparación midi de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Homogeneizar 100 mL de suspensión celular de P. lacuna (ver tabla de materiales) a 10.000 rpm durante 3 min. Mida OD a 750 nm (valor deseado = 0,35).
5. Centrifugar la suspensión celular durante 15 min a 6.000 × g. Retire el sobrenadante y suspenda el sedimento en 800 μL (volumen total incluyendo líquido residual y filamentos) del líquido restante y medio f/2⁺ adicional.
6. Tome ocho placas de bacto-agar f/2⁺ (10 cm de diámetro) que contengan 120 μg/mL de kanamicina. Pipetear 10 μg de ADN en el centro de cada placa de agar. Pipetear inmediatamente 100 μL de suspensión celular en el centro de cada placa de agar (encima del ADN).
7. Mantenga la placa de agar sin tapa en el banco limpio para permitir que el exceso de líquido se evapore. Cerrar el plato y cultivarlo con luz blanca a 25 °C durante 2 días.
8. Distribuir los filamentos de cada placa de agar con un asa de inoculación en varias placas frescas de bacto-agar f/2⁺ que contengan 120 μg/mL de kanamicina. Cultive las placas con luz blanca a 25 °C y revise los cultivos regularmente bajo un microscopio.
9. Identifique filamentos vivos y transformados después de 7-28 días bajo el microscopio. Busque filamentos verdes sanos (Figura 1) que sean diferentes de otros filamentos. Si se pueden identificar estos filamentos verdes, continúe con el siguiente paso; de lo contrario, guarde el plato por otros 7 días.
10. Use fórceps para transferir estos filamentos vivos identificados a 50 ml de medio líquido f / 2⁺ con 250 μg / ml de kanamicina. Cultivar con luz blanca a 25 °C en un agitador (rotación horizontal, 50 rpm). Observe el crecimiento hasta por cuatro semanas.
11. Transfiera los filamentos nuevamente a un medio de agar que contenga 250 μg / ml de kanamicina y espere a que los filamentos crezcan. Después de varios días, transfiera los filamentos individuales a una placa de agar fresca con una mayor concentración de kanamicina, por ejemplo, 500 μg / ml. Conserva la placa original.
12. Asegúrese de que los filamentos se propaguen en una alta concentración de kanamicina en cultivo líquido o en agar. Aumente la concentración de kanamicina nuevamente para acelerar la segregación. NOTA: P . lacuna transformada crece en hasta 10,000 μg / mL de kanamicina. Otras especies podrían no tolerar concentraciones tan altas.
13. Para la expresión de GFP: observe filamentos individuales con un microscopio de fluorescencia con un aumento del objetivo establecido en 40x o 63x. Capture una imagen de transmisión de campo claro y una imagen de fluorescencia. Utilice los siguientes ajustes para GFP: paso de banda de 470 nm para excitación, paso de banda de 525 nm para emisión y un divisor de haz de 495 nm, tiempo de exposición inicial de 500 ms.
14. Ajuste el tiempo de exposición para obtener señales de fluorescencia claras, evitando intensidades saturadas. Intente usar la misma configuración para todas las muestras.
15. Como los filamentos de tipo salvaje también mostrarán fluorescencia, capture imágenes con la misma configuración que la anterior para esta fluorescencia de fondo. NOTA: La cepa que expresa GFP debe tener una señal más alta; de lo contrario, no está expresando GFP.
16. En función de los tiempos de exposición y las intensidades de píxeles de las imágenes de fluorescencia, calcule y compare el contenido de GFP de los diferentes filamentos.

Resultados

Figura 1. Filamentos de Phormidium lacuna 5 semanas después de la transformación. Se utilizó el vector de expresión sfGFP pMH1; la selección se realizó en medio f/2 con 120 μg/mL de kan...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
Microscopio de fluorescencia ApoTome	Zeiss
Microscopio de fluorescencia Axio Imager 2	Zeiss
Kanamicina	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Microscopio DM750	Zeiss
Kit de extracción de plásmidos de preparación midi Kit NucleoBond Xtra Midi	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
Fuente de luz, tubo fluorescente L18W/954 luz diurna	OSRAM		Cultivo de cianobacterias
Fuente de luz, panel LED XL 6500K 140 W	Estrella de floración	N/A	Cultivo de cianobacterias
Placas de Petri de poliestireno, 100 mm x 20 mm	Merck	P5606-400EA
Placas de Petri de poliestireno, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Pipetman 100-1.000 μL	Gilson	Referencia: FA10006M
Pipetman 10-100 μL	Gilson	Referencia: FA10004M
Pipetas de plástico de 10 ml, estériles	Greiner	607107
Shaker Unimax 2010	Instrumentos Heidolph		Para cultivo
Tubo de plástico, estéril, 50 mL	Greiner	227261
Trituradora Silenciosa Ultraturrax M	Instrumentos Heidolph		Homogeneizador
F/2+ medio líquido	f/2-medio, con NaNO₃ y NaH₂PO₄ 10 veces mayores (0,88 mM de NaNO₃, 36 μM de NaH₂PO₄
Agar F/2+-	Agar bacto al 3 % (p/v), agua de mar artificial, solución de oligoelementos al 0,1 % (v/v), solución vitamínica al 0,05 % (v/v), 8,8 mM de NaNO₃, 0,36 mM de NaH₂PO₄