Imágenes bioluminiscentes de la progresión del tumor de mama en un modelo de ratón hembra

Resumen

Fuente:
Marina Arantes Radicchi¹, Victor Carlos Mello¹,
Victória Paz Machado¹, Márcia Cristina Oliveira da Rocha¹, Jaqueline Vaz de Oliveira¹, Luana Cristina Camargo^1,2, Luís Alexandre Muehlmann¹, Ricardo Bentes Azevedo¹, Sônia Nair Bao¹, João Paulo Figueiró Longo<sup>1

1</sup>Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Brasilia, ²Departamento de Procesos Psicológicos Básicos, Instituto de Psicología, Universidad de Brasilia

Este video demuestra el procedimiento para rastrear la progresión tumoral in vivo mediante la inyección de células de adenocarcinoma de mama que expresan luciferasa en un ratón hembra y el monitoreo de señales bioluminiscentes para evaluar el crecimiento tumoral primario y metastásico a lo largo del tiempo

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Cultivo celular

1. Mantener la línea celular 4T1 (ATCC-CRL-2539), una célula murina de adenocarcinoma de mama, en cultivo con medio DMEM (medio eagle modificado de Dulbecco) suplementado con suero bovino fetal al 10% (v:v), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 U/mL), a 37 °C y en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO₂.
2. Transfecte la línea celular original con el gen Luc2, que expresa luciferasa. Esta enzima bioluminiscente se produce constitutivamente.

2. Modelo animal - Trasplante de células tumorales

1. Inocular subcutáneamente células 4T1 bioluminiscentes que expresan luciferasa (2 × 10⁵ células por ratón) en el dorso izquierdo de ratones hembra Balb/c bajo anestesia (ketamina y xilacina a 80 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente).
   1. Para este procedimiento, anestesiar al ratón antes del experimento mediante inyección intraperitoneal de los agentes anestésicos especificados (ketamina y xilacina a 80 y 10 mg / kg, respectivamente).
   2. Después de 5 min de inducción de anestesia, afeitar al ratón e inyectar las células por vía subcutánea con jeringas de insulina de 1 ml.
      NOTA: Se utilizaron un total de cinco ratones de 8 semanas de edad, con un peso aproximado de 25 g cada uno, para la inducción tumoral y la obtención de imágenes.
2. Para cuantificar el crecimiento tumoral in vivo, evalúe el ratón portador del tumor mediante imágenes bioluminiscentes, mediante el monitoreo del crecimiento tumoral durante 4 semanas.
   1. Para experimentos de bioimagen, anestesiar al ratón con isoflurano (2,5% diluido en aire comprimido purificado). Para evaluar la progresión del tumor, obtenga imágenes del ratón una vez a la semana durante 4 semanas utilizando un equipo que mide las señales bioluminiscentes.
      NOTA: La señal bioluminiscente de luciferasa 4T1-luc se utilizó como parámetro para evaluar el crecimiento e indicar la progresión tumoral.
3. Durante el proceso de obtención de imágenes, coloque el ratón en una posición dorsal recostada dentro del área designada del equipo para capturar las imágenes bioluminiscentes.
4. Después de la anestesia, inyecte al ratón D-luciferina (100 μL; 15 mg/mL) por vía intraperitoneal.
   NOTA: Dado que la D-luciferina es un sustrato para la enzima luciferasa, que produce fotones de luz cuando se escinde, y las células de luciferasa bioluminiscentes 4T1 expresan esta enzima de forma constitutiva, cuantificar y detectar el tumor en animales vivos.
5. Para detectar señales, capture 20 imágenes bioluminiscentes durante 20 minutos para cada animal en cada punto final. Cada una de estas imágenes representa la señal bioluminiscente emitida durante un período de 60 s.
6. Construya una curva cinética bioluminiscente que represente la señal emitida cada minuto. Para garantizar resultados óptimos para cada animal, registre la emisión bioluminiscente máxima para cada punto final.
7. Para la captura de imágenes de bioluminiscencia, utilice los siguientes parámetros: filtro de emisión abierto, sin excitación, binning 8, f/stop 2 y campo de visión tipo D. Para generar una curva de crecimiento, obtenga imágenes de los animales una vez a la semana durante un total de 4 semanas.
8. Imágenes de bioluminiscencia - Tumor primario y metástasis pulmonar.
   1. Para distinguir entre las señales de metástasis del tumor primario y del pulmón, defina regiones específicas de interés utilizando el software del equipo.
   2. Identificar señales bioluminiscentes en el lugar de la inyección y en la región torácica donde las células hicieron metástasis. Con base en estas imágenes, calcule la progresión de la señal bioluminiscente, que se correlaciona fuertemente con la progresión tumoral.
   3. Con imágenes recopiladas durante varias semanas, cree un perfil cinético de crecimiento para los diferentes sitios tumorales, incluido el tumor primario y las lesiones metastásicas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
D-luciferina	Perkin Elmer	122799	Reactivo químico
Mediación del águila modificada de Dulbecos	Gibko	A7030	Medios de cultivo celular
Suero fetal bovino	Merck	F2442	Suplemento de medios de cultivo celular
Isoflurano	Cristália	NA	Anestésicos
IVIS Lumina	XR	Serie III	Equipo – EE. UU.
Penicilina	Merck	P4333	Antibiótico de cultivo celular
Faloidina-Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	Referencia A12379	Reactivo químico
Solución salina tampón de fosfato	Merck	4437568	Reactivo químico
Estreptomicina	Merck	P4333	Antibiótico de cultivo celular