Generación de películas bacterianas de nanocelulosa embebidas en magnetita

Resumen

Fuente: Arias, S. L., et al. Fabricación de una nanocelulosa bacteriana magnética funcionalizada con nanopartículas de óxido de hierro. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra la síntesis in situ de nanopartículas de magnetita dentro de una película bacteriana de nanocelulosa producida por Gluconacetobacter xylinus. Explica cómo se genera la nanocelulosa bacteriana magnética mediante la infusión de iones de hierro, la precipitación alcalina y la purificación.

Protocolo

1. Síntesis de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de polímero y su deposición en una membrana de nanocelulosa bacteriana (BNC)

1. Burbujea 1.000 ml de agua de alta pureza con gas nitrógeno para eliminar cualquier oxígeno disuelto del agua y reemplazarlo por nitrógeno.
2. Utilice un matraz de tres cuellos con fondo redondo para preparar una solución en una proporción molar de cloruro (III) hexahidrato de hierro (III) (FeCl_{3,6H 2}O) y cloruro de hierro (II) tetrahidrato (FeCl_{2,4H 2}O) diluido con agua desoxigenada de alta pureza. Por ejemplo, utilice 5,4 g de FeCl_{3,6H 2}O y 1,98 g de FeCl 2,4H₂O en 10 ml de agua desoxigenada de alta pureza. Si esta preparación se vuelve demasiado viscosa y difícil de remover, se utilizan 0,54 g de FeCl_{3,6H 2}O y 0,198 g de FeCl 2,4H₂O en 20 ml de agua desoxigenada de alta pureza.
   NOTA: Reduce el tiempo de exposición del FeCl_{2.4H 2}O al aire pesando este compuesto químico lo más rápido posible. Una vez introducido en el matraz de fondo redondo de tres cuellos, cierra el matraz de tres cuellos con tapones de tabique hasta que esté conectado al suministro de gas nitrógeno y al tubo del condensador.
3. Utiliza dos cuellos del recipiente para proporcionar una entrada y salida constante de gas nitrógeno conectando el suministro de gas nitrógeno a una aguja perforada en un tapón de tabique y fijada a los cuellos del recipiente.
4. Coloca 1 película BNC (15,6 mm de diámetro y 2-3 mm de grosor) en el recipiente junto con los reactivos. Asegúrate de que la muestra esté completamente sumergida en el líquido.
5. Conecta el cuello restante del recipiente a un tubo condensador. Además, utiliza un tubo de secado lleno de sulfato de calcio anhidro sobre el tubo del condensador. Haz pasar agua por el tubo del condensador.
6. Sella todas las uniones de vidrio con grasa al vacío.
7. Calienta la solución en un baño de aceite de silicona a 80 °C usando una placa de remoción y mantén esta temperatura hasta el paso 1.10. Usa una pequeña barra magnética para mezclar los reactivos a 350 rpm durante 5 minutos. Asegúrate de que el BNC esté correctamente impregnado con la solución ferrosa y que los reactivos estén completamente disueltos. Sigue removiendo la mezcla hasta el final del experimento.
   NOTA: Utiliza un termómetro para verificar la temperatura del aceite de silicona. Debería mantenerse estable hasta 80 °C.
8. Aumenta la velocidad de agitación a 700 rpm y añade (bajando), en un intervalo de 5 minutos, 5 ml de hidróxido de amonio (NH₄OH, 14%) a los 10 ml de solución ferrosa usando una aguja de pipeteo, que también ha sido perforada en un tapón de septo. Tras la adición del hidróxido de amonio, el color de la solución cambia de amarillo/naranja a negro.
9. Sigue removiendo la solución a 80 °C durante otros 5 minutos. Evita agitaciones a alta velocidad para mantener la integridad de la muestra. Las altas velocidades, es decir, superiores a 1.000 rpm, pueden destruir la muestra.
10. Baja la temperatura de la solución a 30 °C usando la base de control de temperatura de la placa de agitación y sigue removiendo durante otros 5 minutos. Luego, apaga la placa eléctrica. En este punto, las nanopartículas de óxido de hierro (IONPs) se han incorporado a la malla BNC.
11. Enfría la mezcla hasta temperatura ambiente (RT) y separa las nanopartículas magnéticas (MNPs) y el BNC usando un imán permanente fuerte (por ejemplo, 1 Tesla). Para ello, transfiere la mezcla a un matraz de recipiente y luego, manteniendo el imán cerca del recipiente, mantiene los MNP y el BNC en su lugar mientras se decanta el sobrenadante.
    Nota: Ten cuidado al manipular imanes fuertes, ya que pueden ser dañinos si se usan incorrectamente. Para los pasos (1.12) - (1.14) y (1.16) utiliza el agua desoxigenada de alta pureza preparada previamente en (1.1) para evitar la oxidación de las partículas.
12. Resuspende los MNP y BNC en 100 ml de agua. Sacude suavemente la solución para eliminar todos los MNP que no estén fuertemente incorporados en el BNC. Vuelve a decantar el sobrenadante manteniendo los MNP y el BNC en su lugar usando el imán.
13. Lava los MNP y el BNC varias veces con agua hasta que el sobrenadante alcance un pH neutro (pH~7), medido con una tira colorimétrica.
14. Separa el BNC funcionalizado magnéticamente o nanocelulosa bacteriana magnética (MBNC) de los MNP usando pinzas y enjuaga el MBNC varias veces con agua hasta que el agua se aclare.
15. Esteriliza el MBNC exponiéndolo al UV (110-280 nm).
16. Autoclave 500 ml de agua desoxigenada de alta pureza a 120 °C durante 20 minutos y almacenar el MBNC en 20 ml de esta agua.
17. Asépticamente, sumergir la muestra en un 1% de polietilenoglicol (PEG) y remover durante 2 horas a RT (37 °C). Este procedimiento mejora la biocompatibilidad y estabilidad de las nanopartículas de óxido de hierro depositadas en el BNC, especialmente las expuestas en la superficie. El recubrimiento PEG se distribuirá a lo largo de la red 3D MBNC.
    NOTA: Los IONP desnudos se oxidan fácilmente en el aire debido a su alta actividad química. Aunque el PEG se considera un material no biodegradable, su estabilidad química depende de las condiciones biológicas aplicadas como el contenido de agua, el pH, la temperatura, la presencia de enzimas, especies reactivas de ogénito, especies reactivas de nitrógeno y otras.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Cloruro de Hierro (III) hexahidrato	Sigma Aldrich	236489-100G
Hidróxido de amonio	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poli (Etilenglicol), media Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Cloruro de hierro (II) tetrahidrato	Sigma Aldrich	44939-250G
Sulfato de calcio anhidro	Drierita W.A. Hammond	13001
Grasa de alto vacío	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Tiras de pH	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Matraz destilador tipo triple de ángulo de cuello con fondo redondeado	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Aceite de silicona para baños de aceite	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Tubo de secado	Chemglass	CG-1295-01
Tapón de tabique, tipo manga	Chemglass	CG-3022-98
Barra de agitación magnética	Chemglass	CG-2001-05
Condensador	Chemglass	CG-1218-01
Controlador de temperatura	BriskHeat	SDC120JC-A
Placa eléctrica de agitación	Fisher Scientific	11-100-49SH