Ensayo fluorescente de alto rendimiento para estudiar las interacciones microbio-gusano

Resumen

Fuente: Ali, I., et al. Cribado de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demuestra un ensayo fluorescente de alto rendimiento para evaluar cómo las bacterias intestinales afectan la resiliencia al estrés en Caenorhabditis elegans. Al rastrear la fluorescencia azul de los gránulos intestinales rotos, el ensayo revela señales de muerte más tempranas en gusanos expuestos a bacterias de prueba.

Protocolo

1. Configuración de Caenorhabditis elegans (C. elegans) sin etiqueta para la puntuación de supervivencia (LFASS) y preparación de ensayo oxidativo (Días 13 - 14)

1. Evalúa la etapa de desarrollo de los gusanos. Una vez que el >90% de los gusanos han alcanzado L4, recolectar los gusanos en hasta 10 mL de solución estéril de M9 en tubos cónicos de 15 mL.
2. Lava las lombrices a fondo (al menos 4 veces) centrifugando a 142xg durante 2 minutos a 4 °C, retirando el sobrenadante y añadiendo 10 mL de M9 estéril fresco entre cada lavado para eliminar la bacteria Escherichia coli OP50. Resuspende el pellet de lombriz en 10 mL de M9.
3. Transfiere 50 μL de solución de gusano a un tubo de unión de baja superficie que contenga 950 μL de M9. Tras mezclar suavemente el contenido del tubo para evitar la sedimentación de gusanos, se utiliza rápidamente una punta de pipeta de baja unión humedecida para transferir 3-4 gotas separadas de 10 μL a una lámina de vidrio o a una placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM). Cuenta los números de gusano bajo un estereomicroscopio a 16x de ampliación. Promedia los conteos de las 3-4 gotas y determina el número de gusanos por microlitro en la solución de gusanos.
4. Ajusta la concentración de gusanos en el tubo de 10 mL para alcanzar ~120 gusanos en 8 μL. Si la solución se preparó en el Paso 1.2. no se concentra lo suficiente, girar los gusanos hacia abajo y eliminar M9 en consecuencia para alcanzar 120 gusanos por 8 μL.
5. Transfiere 8 μL de solución de gusano (~120 gusanos) a cada uno de los pozos de las ocho placas de NGM-agarosa de 96 pozos previamente preparadas, utilizando una pipeta multicanal o una pipeta de repetición. Asegúrate de usar puntas de baja retención para limitar la pérdida de gusanos. También puede ser necesario cortar los extremos de las puntas para permitir la entrada de gusanos adultos grandes y así limitar el estrés mecánico sobre los adultos.
   NOTA: El ensayo requiere un mínimo de 30 gusanos vivos para funcionar de forma fiable, pero funciona mejor con unos 100 gusanos por pozo.
6. Incubar las placas de NGM-agarosa de 96 pozos y semillas de bacterias a 25 °C durante 36 horas.
7. Revisa las placas entre 12 y 24 horas, asegurándote de que los gusanos permanezcan llenos durante todo el tiempo. Si es necesario realimentarse, resuspende las bacterias dentro de la placa de matriz bacteriana de 96 pozos almacenada a 15 °C, y añade hasta 10 μL de la solución bacteriana correspondiente a las placas de NGM-agarosa de 96 pozos donde los gusanos corren riesgo de morir de hambre antes de que termine el periodo de incubación de 36 horas (los gusanos hambrientos producirán resultados muy diferentes, Así que esto es muy importante).
   NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en el día 15. Antes de comenzar el ensayo, puede ser necesario optimizar la altura de lectura. La lectura óptima se logrará entre 20 y 50 μm por encima del fondo del pozo. Esto dependerá del modelo del lector de placas. Algunos ofrecen la posibilidad de un escaneo Z, mientras que otros permiten la entrada manual de altura. Establece la altura óptima en el nivel donde se detecta la mayor fluorescencia azul (365 nm/430 nm). Algunos lectores de placas pueden funcionar a una altura fija optimizada para ensayos de células adherentes y pueden no ser ideales para ensayos LFASS.
8. Tras 36 horas, dispensar 30 μL de M9 en cada pozo de la placa de 96 pozos.
   NOTA: Para los ensayos de tensión térmica, el lector de placas debe haber alcanzado la temperatura requerida para realizar el ensayo y puede ser necesario activarlo con antelación. El protocolo actual utiliza 42 °C para maximizar la velocidad de eliminación, pero el enfoque se aplica a otras temperaturas superiores a 30 °C.
9. Transfiere los gusanos (unos 20 μL) a la placa de 384 pozos según los diseños del conjunto, usando puntas de baja retención (considera cortar el extremo de las puntas para permitir que los gusanos grandes reduzcan el estrés mecánico en los gusanos adultos).
   NOTA: Para el presente estudio, se utilizan dos configuraciones diferentes de lectores de placas para los dos ensayos aquí descritos (tensión térmica y tensión oxidativa), por lo que las muestras destinadas a estos dos ensayos no deben estar enchapadas en la misma placa de 384 pozos.
10. Asegúrese de que los lectores de placas estén correctamente configurados (Tabla 1).
11. Recarga las placas de 384 pozos con más M9, buscando un volumen final de 60 μL por pozo. Para el ensayo de estrés térmico, añadir 40 μL de M9, y para el estrés oxidativo inducido por tert-butil hidroperóxido (t-BHP), añadir 34 μL de M9 en 6 μL de t-BHP.
    1. Comienza el ensayo en un plazo de 2 minutos tras añadir t-BHP (idealmente, todos los gusanos deben estar expuestos a t-BHP simultáneamente, con una resolución en tiempo de ensayo de 2 minutos). Si no es posible, utiliza un temporizador para estimar el tiempo que se pasa pipeteando t-BHP antes del inicio del ensayo para permitir un ajuste posterior de la hora mediana de la muerte.
12. Cierra los platos con su tapa transparente. Sella los bordes de las placas de 384 pozos con cinta de enmascarar (tapando la placa y la tapa), asegurando que la cinta no pase por encima de la tapa ni por debajo de la placa. Corta la cinta entre la tapa y la placa a intervalos usando un bisturí para permitir el intercambio de aire minimizando la evaporación durante el ensayo.
13. Introduce la placa en el lector de placas y comienza la corrida. Procura excitar a 365 nm y detectar emisión a 435 nm cada 2 minutos durante 6-12 horas (Tabla 1).
    NOTA: Normalmente, 6 h son suficientes para ensayos de estrés térmico a 42 °C y 8 h para ensayos de estrés oxidativo al 7% t-BHP.

Tabla 1: Ajustes de ensayo oxidativo y de estrés térmico. Ejemplos de ajustes utilizados para ensayos de estrés oxidativo (A) y térmico (B) en los lectores de placas de fluorescencia utilizados en este estudio.

Materiales