Extracción de bacterias apoplásicas usando un método de presión basado en jeringuilla

Resumen

Fuente: Rufián, J. S., et al, Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae en el tejido vegetal. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demuestra un método de presión basado en jeringuilla para extraer bacterias apoplásicas, que proliferan y forman microcolonias dentro del apoplasto, el espacio intercelular entre las células vegetales. El método proporciona muestras bacterianas libres de residuos adecuadas para análisis de células individuales posteriores.

Protocolo

Extracción de bacterias del apoplasto

1. Cuatro días después de la inoculación, corta la parte aérea de la planta de Arabidopsis o la hoja inoculada de la planta de judía y colócala en una jeringuilla de 20 mL sin aguja (Figura 2G). Para las hojas de judía, enrolla la hoja sobre sí misma, dejando la cara abaxial hacia fuera, como se muestra en la Figura 2F.
2. Añade suficiente volumen de agua destilada para cubrir el tejido (normalmente 10-15 mL).
3. Introduce el émbolo y, con la jeringuilla en posición vertical y la punta apuntando hacia arriba, elimina el exceso de aire y burbujas dentro de la jeringuilla golpeando suavemente el cañón hasta que todo el aire esté cerca de la punta. Desliza el émbolo para sacar el aire. Cuando haya la menor cantidad de aire posible dentro de la jeringuilla, cubre la punta del barril con película de parafina.
4. Presiona cuidadosamente el émbolo para generar presión positiva hasta que el tejido se oscureza (Figura 1I y Figura 2H). Luego, tira del émbolo para generar presión negativa (Figura 1J y Figura 2I). Repite este paso 3-5 veces.
5. Retirar la película de parafina y el émbolo y recoger el líquido que contiene las bacterias extraídas del apoplasto, como en la Figura 2J.

Resultados

Figura 1: Inoculación bacteriana y extracción de apoplastos utilizando plantas de Arabidopsis. (A) Preparación de la maceta con la malla metálica correctamente sujeta. (B)<...

Materiales