Una técnica de cromatografía de afinidad para la purificación de una proteína bacteriana recombinante

Resumen

Fuente: Becker, B., et al. Un ensayo reportero simple basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para el tráfico de la cadena de la toxina A de la ricina (RTA) en levaduras. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demuestra la purificación de una proteína recombinante marcada con polihistidina mediante cromatografía de afinidad basada en níquel. Detalla pasos clave, incluyendo la lisis bacteriana por sonicación, la clarificación y filtración del lisato, y la unión selectiva y elución de la proteína objetivo mediante imidazol.

Protocolo

1. Purificación de los RTA marcados con His mediante cromatografía de afinidad

1. Sonicar las células sobre hielo usando el siguiente protocolo: pulso de 15 s (20 micras), pausa de 30 s. Repite este paso cinco veces.
2. Lisado de celda centrífuga a 21.000 x g y 4 °C durante 15 minutos y filtrar el sobrenadante usando un sistema de filtro con jeringuilla estéril (poro de 0,2 μm).
   NOTA: Los pellets celulares de muestras sonicadas con éxito muestran bordes transparentes.
3. Utiliza un sistema automatizado de purificación equipado con una columna de afinidad basada en Ni²+ de 5 mL para purificar la fracción de RTA marcada con Him del sobrenadante E. coli filtrado por estéril. En general, utiliza una velocidad de elución de 1 mL/min y enfría todo el sistema de purificación para evitar la unión ineficiente de toxinas y la pérdida de actividad tóxica.
   NOTA: Los parámetros para una purificación eficiente de RTA se enumeran en la Tabla 1.
   1. En resumen, equilibrar la columna de afinidad con 20 mL de búfer de unión para eliminar el búfer de almacenamiento. Aplica un sobrenadante filtrado estéril sobre la columna de afinidad usando una jeringuilla.
   2. Lava la columna con 25-35 mL de tampón de unión para eliminar las proteínas no unidas de la columna. Realiza el paso de lavado hasta que la absorbancia UV a 280 nm esté cerca del valor inicial de UV.
   3. Fracción RTA unida a eluto en 20-35 mL de tampón de elución (500 mM imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM_{KH 2}PO₄, pH = 7,2) y mantener la muestra sobre hielo (Figura 1A y Figura 1B).
      NOTA: La elución de la fracción RTA se caracteriza por un aumento en la absorción de rayos UV. Por favor, tenga en cuenta que debe recoger exclusivamente esta fracción para evitar la contaminación con proteínas unidas inespecíficas.

Tabla 1: Parámetros utilizados para la purificación de afinidad basada en columnas y la desalación. Lista de todos los ajustes relevantes de la columna (por ejemplo, caudal, concentración del tampón de elución, equilibrio y duración del paso de lavado) y parámetros medidos (por ejemplo, conductancia o absorción UV).

Parámetro de cromatografía de afinidad
Parámetros de medición	UV (280 nm), concentración del tampón de elución, conductancia
Configuración	Variable/Unidad	Valor
Gasto	mL/min	1
Presión máxima en la columna	Mpa	0.35
Longitud de onda	Nm	280 nm
Búfer de enlace	Posición de la bomba	Un
Amortiguador de elución	Posición de la bomba	B
Amortiguador de elución de concentración inicial	%	0
Compensación de volumen del sistema	Ml	10
Equilibrio de columnas	Ml	20
Inyección de muestra sobre superloop/jeringa	Ml	Volumen del lisado celular
Paso de lavado	Ml	20-35
Paso de elución	Ml	20-35
Amortiguador de elución de concentración durante la elución	%	100
Recalibración de la columna con 20% de EtOH	Ml	50
Parámetro de desalación
Parámetros de medición	UV (280 nm), Conductancia
Configuración	Variable/Unidad	Valor
Gasto	mL/min	4
Presión máxima en la columna	Mpa	0.35
Longitud de onda	Nm	280 nm
Búfer de enlace	Posición de la bomba	Un
Amortiguador de elución	Posición de la bomba	B
Amortiguador de elución de concentración inicial	%	0
Compensación de volumen del sistema	Ml	10
Equilibrio de columnas	Ml	20
Inyección de muestra sobre superloop/jeringa	Ml	Volumen del lisado celular
Inyección de tampón desalificante (sorbitol de 0,8 M)	Ml	100
Recalibración de la columna con 20% de EtOH	Ml	50

Resultados

Figura 1: Cromatografía de afinidad representativa y resultados de desalación de células de E. coli que contienen pET-RTA_(His)6 o el control vectorial vacío. (A) Grafo típico de purifica...

Materiales