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1. Preparación de nanocelulosa bacteriana (BNC)
Nota: Todos los pasos se realizan en condiciones asépticas, salvo que se indique lo contrario.
- Prepara el medio de cultivo.
- Prepara 500 ml de medio de cultivo líquido combinando 25 g de extracto de levadura, 15 g de peptona, 125,0 g de manitol y 500 ml de agua de alta pureza. Autoclave esta mezcla a 120 °C durante 20 minutos y guárdala a 4 °C.
- Prepara 100 ml de medio semisólido añadiendo 15 g de agar a 5,0 g de extracto de levadura, 3,0 g de peptona, 25,0 g de manitol y 100 ml de agua de alta pureza. Autoclave esta mezcla a 120 °C durante 20 minutos. Una vez autoclave, deposita 5 ml de la mezcla en una placa de Petri de plástico de 90 mm x 16 mm. Deja que la solución se gelifice a 4 °C y guárdala a esta temperatura hasta que se use más.
- Rehidratar la cepa de Glucoacetobacter xylinus (G. xylinus) conservada en viales liofilizados añadiendo 1 ml de medio de cultivo líquido y pipeteando arriba y abajo, según indica las instrucciones del fabricante.
- Inocular las placas de Petri que contienen medios semisólidos con pequeñas gotas de suspensión bacteriana utilizando un lazo inoculador. Asegúrate de que el inóculo cubra toda la placa de Petri moviendo el lazo en zigzag desde el borde hasta el centro de la placa.
- Incubar las placas de Petri a 26 °C durante 72 horas en una incubadora sin CO2. Una vez completado el periodo de incubación, se pueden ver pequeñas colonias blancas. Si no se usan las colonias de inmediato, guarda las placas de Petri a 4 °C sellando la tapa con Parafilm y colocando las placas boca abajo. Las colonias pueden almacenarse así hasta durante 6 meses.
- Transfiere 2 ml del medio de cultivo líquido en cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos. Toma dos colonias con una aguja inoculadora de las placas de Petri inoculadas y colócalas en el primer pozo de la placa de cultivo de tejidos. Repite el mismo procedimiento para los 23 pozos restantes.
- Incubar la placa de cultivo de tejido a 30 °C durante 7 días. Esto dará un total de 24 películas BNC con un diámetro de 16 mm y un grosor de aproximadamente 2-3 mm de diámetro, como se muestra en la Figura 1. Nota: No alteres el cultivo bacteriano en ningún momento durante el periodo de incubación, por ejemplo, agitando las placas. Durante el periodo de incubación, G. xylinus extruye moléculas de azúcar de glucopiranosa para formar una malla cristalina polimérica en la interfaz aire-líquido, que adopta la forma y tamaño del matraz bajo condiciones de cultivo estáticas. Esta matriz polimérica, conocida como nanocelulosa bacteriana (BNC), es visible al final del periodo de incubación.
- Recoger las películas de BNC del medio de crecimiento y esterilizarlas en 200 ml de solución de NaOH al 1% durante 1 hora a 50 °C, para eliminar todas las huellas de G. xylinus. Opcionalmente, remueve esta solución a 300 rpm usando una barra magnética y una placa de agitación. Descarta la solución de NaOH y añade 200 ml de solución de NaOH al 1% recién preparada. Repite el mismo proceso una vez más o hasta que las películas BNC en solución adquieran un aspecto translúcido.
- Enjuaga las películas BNC con agua tres veces y guárdalas en agua de alta pureza en RT. Asegúrate de que las películas BNC estén completamente sumergidas en el agua y que no se les permita secar en ningún momento.
- Autoclave de las películas BNC a 121 °C durante 20 minutos. Nota: Un estudio subcutáneo in vivo en la rata realizado por Märtson y sus colaboradores no mostró signos de degradación del BNC tras las 60 semanas de implantación. De hecho, el BNC es degradable en la naturaleza por enzimas microbianas y fúngicas, que están ausentes en los mamíferos. Por otro lado, la biodegradabilidad del BNC puede ser resultado de procesos mecánicos, químicos y biológicos que debilitan la red de microfibrillas in vivo.
