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1. Preparación de productos químicos y equipos
1. Elaborar 500 ml de una solución de hexametafosfato de sodio (SHMP) (NaPO3)n al 1% y esterilizar mediante autoclave.
2. Esterilizar los filtros de nitrocelulosa (NC) (tamaño de poro 0,22 μm, diámetro 47 mm) mediante autoclavado en placas de Petri de vidrio cerradas.
3. Esterilizar los filtros NC (tamaño de poro 0,22 μm, diámetro 25 mm) mediante autoclavado en placas de Petri de vidrio cerradas.
4. Pesa y toma nota del peso vacío de tubos estériles de 50 ml (con tapón) (un tubo por muestra).
5. Preparar el tampón Tris-EDTA (tampón TE) 1x: preparar una solución de 10 mM de Tris (tris(hidroximetil)aminometano) y 1 mM de tampón EDTA. Ajusta el pH a 8 y esteriliza mediante autoclave.
6. Preparar la solución de lisozima (20 mg/ml) disolviendo 0,02 g de lisozima en 1 ml de tampón TE. Idealmente, hazlo fresco cada vez. Guárdalos a 4 °C durante no más de 1 semana.
7. Preparar una solución fisiológica disolviendo 8 g/L de cloruro de sodio (NaCl) en agua destilada. Esteriliza mediante autoclave.
2. Separación de biomasa de sedimentos
1. Añadir 3 g de muestra de sedimento a tubos estériles prepesados de 50 ml utilizando cucharas metálicas con flama de etanol. Haz esto en un armario de bioseguridad limpio y esterilizado con rayos UV para evitar contaminaciones.
2. Añadir 15 ml de una solución SHMP estéril al 1% (autoclave) a la muestra utilizando una bureta graduada estéril. La solución SHMP también puede filtrarse para evitar contaminaciones.
3. Homogeneizar el sedimento y la solución de SHMP con un dispersor/homogeneizador líquido (por ejemplo, homogeneizador Ultra-Turrax). Esterilizar o autoclave al 70% el rotor de dispersión antes de su uso. Haz la homogeneización durante 1 minuto a 17.500 rpm. Deja reposar la muestra durante 2 minutos y repite la homogeneización durante 1 minuto a la misma velocidad del rotor.
4. Deja reposar la muestra durante 10 minutos. En este paso, las partículas más pesadas (minerales) se asientarán. Sin embargo, las células y cualquier componente orgánico de la muestra permanecerán en solución. Después, transfiere la solución sobrenadante (que contiene biomasa celular) a un tubo limpio de 50 ml, teniendo cuidado de no alterar la pellet de sedimento.
5. Al pellet de sedimento, añadir de nuevo 15 ml de una solución SHMP estéril al 1% (autoclave) utilizando una bureta graduada estéril. Luego repite los pasos 2.3 y 2.4. Esta repetición asegura la separación de la mayor cantidad de células y partículas orgánicas del componente mineral del sedimento. El sobrenadante de esta segunda separación puede fusionarse con el sobrenadante de la primera separación.
Nota: Los siguientes pasos se realizan todos sobre el sobrenadante (que contiene biomasa celular). El componente mineral (pellet de sedimentos) puede descartarse.
6. Centrifuga la muestra a 20 x g durante 1 minuto. Este paso aumenta la fuerza g lo suficiente para depositar pequeñas partículas minerales mientras el material celular biológico permanece en solución. Tras la centrifugación, transfiere la solución sobrenadante (que contiene biomasa celular) a un tubo limpio de 50 ml. Descarta la bolítula mineral.
7. Determinar el volumen final de la solución que contiene biomasa pesando la muestra. La determinación del peso evita tener que transferir la muestra a un cilindro graduado y reduce el riesgo de contaminación.
3. Recogida de biomasa en la membrana filtrante
1. Preparar una unidad de filtración (para membranas de 47 mm de diámetro) y una bomba de vacío. Esteriliza la unidad de filtración mediante autoclav o (si es vidrio Pyrex) rociándola con etanol al 70% y encendiéndola con un mechero Bunsen. Déjalo enfriar antes de continuar con el protocolo.
2. Añadir una membrana NC estéril a la unidad de filtración utilizando pinzas esterilizadas con llama de etanol.
3. Añadir la mitad de la muestra sobrenadante (del paso 2.6) a la unidad de filtración de membrana y recoger las células de la membrana usando la bomba de vacío.
4. Cuando el líquido haya pasado completamente por el filtro, detener la bomba de vacío y retirar cuidadosamente la membrana usando pinzas esterilizadas con llama de etanol. Coloca la membrana en una placa de Petri estéril.
1. Corta la membrana por la mitad usando tijeras esterilizadas con flama de etanol. Añade cada mitad de la membrana a un tubo separado de 2 ml. La mitad de la membrana se utilizará para la extracción de ADN y el análisis de toda la comunidad bacteriana. La otra mitad del filtro se almacena a -80 °C y sirve como respaldo.
5. Colocar una nueva membrana NC sobre la unidad de filtración y recoger biomasa de la segunda mitad del volumen de muestra (del paso 2.6) usando la bomba de vacío.
6. Cuando el líquido haya pasado completamente por el filtro, detenga la bomba de vacío y retire cuidadosamente la membrana utilizando pinzas esterilizadas con llama a etanol. Coloca toda la membrana en un tubo separado de 2 ml. Esta muestra se utilizará para el tratamiento que separará las endósporas de las células vegetales. La muestra puede almacenarse a -20 °C hasta su uso.
4. Lisis de células vegetativas
1. Realizar el tratamiento para separar las endosporas de las células vegetales sobre la biomasa previamente recogida en una membrana NC (paso 3.6).
1. Si la membrana estaba congelada, déjala en RT durante 10 minutos para que se descongele. Luego, coloca la membrana en una placa de Petri estéril y córtala (aproximadamente 4 veces) en trozos más pequeños usando tijeras esterilizadas con llama de etanol. Luego, coloca todas las piezas del filtro de membrana en un tubo estéril de 2 ml.
2. Añadir 900 μl de tampón 1x TE (Tris-EDTA) (véase 1.5) al tubo que contiene la membrana de la muestra y mezclar cuidadosamente mediante vórtice. En este paso, la biomasa se extrae de la membrana hacia la solución tampón TE.
3. Colocar el tubo en una incubadora a 65 °C durante 10 minutos y 80 rpm. Después, retira el tubo de la incubadora y déjalo enfriar durante 15 minutos.
4. Añadir 100 μl de lisozima recién preparada (véase 1,5) para alcanzar una concentración final de 2 mg/ml. No añadas la lisozima antes de que la muestra se haya enfriado a 37 °C, ya que esto podría degradar la enzima.
5. Incubar la muestra a 37 °C durante 60 minutos y 80 rpm, las condiciones óptimas para que la lisoma las células vegetativas.
6. Una vez completada la lisis, añadir 250 μl de hidróxido de sodio (NaOH) de 3 N y 250 μl de solución de dodecilo sulfato de sodio (SDS) al 6% a la muestra. Al sumar esto, el volumen de la muestra alcanza 1,5 ml, y se obtiene una concentración final de 0,5 N NaOH y una concentración final del 1% de SDS.
7. Incuba esta mezcla en RT durante 60 minutos y 80 rpm. Añadir la base y los detergentes ayudará en la lisis celular final. La concentración de estos detergentes ha sido optimizada para no dañar las endosporas durante la lisificación de las células vegetales.
8. Preparar una unidad de filtración estéril que contenga membranas de 25 mm de diámetro mediante autoclav, o (si es vidrio Pyrex) rociarla con etanol al 70% y encender fuego con un mechero Bunsen. Déjalo enfriar.
9. Colocar una membrana NC de 0,2 μm (25 mm de diámetro) sobre la unidad de filtración utilizando pinzas esterilizadas con llama de etanol.
10. Añadir la muestra del paso 4.7 a la membrana y filtrar el líquido usando la bomba de vacío. Cuando haya pasado líquido, apaga la bomba de vacío. En este paso, se elimina el material celular vegetal lisado, ya que no se retiene en la membrana. Solo permanecerán endósporas en la membrana.
11. Añadir 2 ml de solución fisiológica estéril para eliminar los detergentes residuales y filtrar el líquido usando la bomba de vacío.
12. Cuando el líquido esté completamente filtrado, apague la bomba de vacío. Deja la membrana en la unidad de filtración.