Generación de cultivos bacterianos puros en un medio líquido

Resumen

Fuente: Brumfield, K. D. et al., Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar biotipos de aislados clínicos y ambientales de Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo muestra el crecimiento de cultivos bacterianos en un medio líquido. El agitado favorece la aireación y distribuye los nutrientes de manera uniforme, apoyando un crecimiento exponencial y resultando en una suspensión uniforme y metabólicamente activa, adecuada para aplicaciones aguas abajo.

Protocolo

1. Mantenimiento y crecimiento de cepas de Vibrio cholerae

1. Preparación y uso de cultivos de ganado congelado
   1. Pellet 1,8 mL de cultivo líquido durante la noche durante 2 minutos mediante centrifugación (≥8.600 x g) en un tubo estéril de microcentrífuga de 2 mL, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 900 μL de caldo fresco Luria-Bertani (LB) mediante pipeteo.
   2. Añade 900 μL de glicerol estéril al 60% (v/v) al cultivo y mezcla mediante vórtice.
   3. Transfiere la mezcla a un tubo criogénico estéril de 2 mL y guárdalo indefinidamente a -80 °C.
   4. Para utilizar, retira una pequeña cantidad de fondo congelado usando un lazo inoculante estéril y una raya para las colonias individuales en placas de agar LB. Inmediatamente devuelve el stock congelado a -80 °C tras su uso para evitar que los cultivos se descongelen por completo. Incubar las placas con la tapa hacia abajo durante 12 a 16 horas a 37 °C.
2. Crecimiento de cultivos nocturnos en medio líquido
   1. Traza para colonias individuales (según la sección 1.1.4) desde material congelado sobre placas de agar LB. Incubar las placas con la tapa hacia abajo durante 12 a 16 horas a 37 °C.
   2. Inocular 4 mL de caldo LB líquido en un tubo de cultivo estéril de 10 mL con una sola colonia tocando la superficie de la colonia individual con un aplicador estéril y transfiriendo la colonia al caldo líquido.
   3. Incubar con aireación en un incubador agitador a 225 revoluciones por minuto (rpm) durante 12 a 16 horas a 37 °C.

Materiales