Bloqueo de replicación mediado por proteínas represoras marcadas fluorescentemente en Escherichia coli

En este artículo

Resumen

Fuente: Mettrick, K. A., Lawrence, et al., Induciendo una obstrucción de replicación específica en sitio en E. coli usando un sistema operador de represor fluorescente. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra la obstrucción específica del yacimiento de replicación en Escherichia coli utilizando la expresión inducida por arabinosa de TetR marcado con proteínas fluorescentes amarillas que se une a las matrices cromosómicas de tetO.

Protocolo

1. Bloqueo de replicación con el sistema de operadores de represor de fluorescencia (FROS)

Inducción de la obstrucción de replicación
1. Diluir un cultivo fresco durante la noche de una cepa de E. coli que transporte una matriz tetO y pKM118 a OD₆₀₀nm = 0,01 en un medio complejo diluido (0,1% triptona, 0,05% extracto de levadura, 0,1% NaCl, 0,17 M_{KH 2}PO₄, 0,72 M K₂HPO₄) con antibióticos según sea necesario para la selección.
  NOTA: No añadas tetraciclina para la selección, ya que no es compatible con este sistema. Haz que el volumen del cultivo equivalga a 10 ml por muestra requerida. Por ejemplo, el volumen de cultivo para el diseño experimental en la Figura 1 es de 60 ml.
2. Crece a 30 °C agitando hasta que el diámetro exterior₆₀₀ nm = 0,05-0,1. Retirar una muestra de 10 ml para servir como control no inducido y añadir un 0,1% de arabinosa al cultivo restante para inducir la producción de TetR-YFP a partir de pKM1. Sigue cultivando tanto las culturas no inducidas como las inducidas. Después de 1 hora, comprueba la presencia de un único punto focal dentro de cada célula del cultivo inducido mediante microscopía de fluorescencia.
3. Si se confirma que las células inducidas están bloqueadas (más del 70% de las células tienen un único foco), registrar la difusión_{de 600}nm y tomar una muestra de 7,5 ml para su análisis con geles 2D. Tome una muestra equivalente del cultivo de control no inducido.

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Resultados

Figura 1: Visión general del Procedimiento Experimental de Replicación FROS y de Liberación. Las cepas de E. coli que transportan la matriz tetO se cultivan a 30 °C. Cuando las células alcanzan un OD_{de 600}nm superior a 0,05,...