Bloqueo de replicación mediado por proteínas represoras marcadas fluorescentemente en Escherichia coli

Resumen

Fuente: Mettrick, K. A., Lawrence, et al., Induciendo una obstrucción de replicación específica en sitio en E. coli usando un sistema operador de represor fluorescente. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra la obstrucción específica del yacimiento de replicación en Escherichia coli utilizando la expresión inducida por arabinosa de TetR marcado con proteínas fluorescentes amarillas que se une a las matrices cromosómicas de tetO.

Protocolo

1. Bloqueo de replicación con el sistema de operadores de represor de fluorescencia (FROS)

1. Inducción de la obstrucción de replicación
   1. Diluir un cultivo fresco durante la noche de una cepa de E. coli que transporte una matriz tetO y pKM118 a OD₆₀₀nm = 0,01 en un medio complejo diluido (0,1% triptona, 0,05% extracto de levadura, 0,1% NaCl, 0,17 M_{KH 2}PO₄, 0,72 M K₂HPO₄) con antibióticos según sea necesario para la selección.
      NOTA: No añadas tetraciclina para la selección, ya que no es compatible con este sistema. Haz que el volumen del....

Resultados

Figura 1: Visión general del Procedimiento Experimental de Replicación FROS y de Liberación. Las cepas de E. coli que transportan la matriz tetO se cultivan a 30 °C. Cuando las células alcanzan un OD_{de 600}nm superior a 0,05,.......

Materiales