Amplificación isotérmica mediada por lazo para la detección de genes bacterianos

Resumen

Fuente: Domesle, K. J., et al. Amplificación isotérmica mediada por lazos para el cribado de Salmonella en alimentos de origen animal y la confirmación de Salmonella por aislamiento en cultivo. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demuestra la técnica de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para detectar un gen bacteriano objetivo amplificando el ADN a temperatura constante. La mezcla de reacción se prepara añadiendo una mezcla maestra isotérmica, cebadores específicos para el gen objetivo y muestras que contienen plantillas de ADN. La amplificación se inicia en un instrumento LAMP y se monitoriza la fluorescencia en tiempo real para confirmar la presencia del gen objetivo.

Protocolo

NOTA: Una mezcla de reacción de amplificación isotérmica mediada por lazo (LAMP) contiene ADN polimerasa, tampón, sulfato de magnesio (_{MgSO 4}), trifosfatos desoxinucleótidos (dNTPs), cebadores, plantilla de ADN y agua. Los primeros cuatro reactivos están contenidos en una mezcla maestra isotérmica (Tabla de Materiales). Las imprimaciones se premezclan en la casa para convertirse en una mezcla de imprimación (10 veces). Se pueden preparar plantillas de ADN a partir de caldos de enriquecimiento de muestras de alimentos animales para fines de cribado o a partir de cultivos de aislados presuntos de Salmonella para fines de confirmación. Además, en cada prueba de LAMP se incluyen un control positivo (ADN extraído de cualquier cepa de referencia de Salmonella , por ejemplo, Salmonella enterrica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) y un control sin plantilla (NTC; agua de grado molecular estéril).

1. Preparación de plantillas de ADN

1. Para preparar plantillas de ADN a partir de enriquecimientos de alimentos animales, sigue estos pasos.
   1. Pesa asépticamente 25 g de una muestra de alimento animal (por ejemplo, pienso seco para gatos, pienso seco para perros, pienso para ganado, pienso para caballos, pienso para aves y pienso para cerdos) en una bolsa de filtro estéril (Tabla de Materiales), o equivalente. Coloca la bolsa en un recipiente grande o estante para que te sostenga durante la incubación.
   2. Añade 225 mL de agua peptona estéril tamponada (BPW). Mezcla bien con un masaje en movimiento y un breve masaje de manos. Déjalo reposar a temperatura ambiente durante 60 ± 5 minutos.
   3. Mezcla bien girando y determina el pH con un papel de prueba. Ajusta el pH, si es necesario, a 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio estéril de 1 N (NaOH) o ácido clorhídrico de 1 N (HCl). Incubar a 35 ± 2 °C durante 24 ± 2 horas.
   4. Mezcla bien girando la bolsa que contiene caldos de enriquecimiento de alimentos animales. Transfiere 1 mL desde el lado filtrado de la bolsa a un tubo microcentrífuga. Vórtice brevemente.
   5. Extrae el ADN utilizando un reactivo de preparación de muestra (Tabla de Materiales) de la siguiente manera.
      1. Centrifugar a 900 x g durante 1 minuto para eliminar partículas grandes y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
      2. Centrifuga a 16.000 x g durante 2 minutos y descarta el sobrenadante.
      3. Suspende el pellet en 100 μL del reactivo de preparación de la muestra y calienta a 100 ± 1 °C durante 10 minutos en un bloque de calor seco.
      4. Enfría a temperatura ambiente y almacena los extractos de ADN de la muestra a -20 °C.
2. Para preparar plantillas de ADN a partir de cultivos presuntos de Salmonella , sigue estos pasos.
   1. Obtén aislados presuntos de Salmonella por aislamiento en cultivo en todos los alimentos siguiendo el Capítulo 5 de la FDA del BAM, sección D de Salmonella.
   2. Inocular aislados presuntos de Salmonella en una placa de agar no selectiva (por ejemplo, agar de sangre, agar nutritivo y agar de soja tripticas) e incubar a 35 ± 2 °C durante 24 ± 2 horas.
   3. Transfiere varias colonias individuales a 5 mL de caldo de soja tripticasa (TSB) o caldo de infusión cerebral (BHI) y incuba a 35 ± 2 °C durante 16 ± 2 horas.
      NOTA: Este paso puede ser opcional si el cultivo presunto de Salmonella es puro. En ese caso, las plantillas de ADN pueden prepararse suspendiendo varias colonias individuales en 5 mL de TSB y calentando 500 μL de la suspensión a 100 ± 1 °C durante 10 minutos en un bloque de calor seco. Continúa con el paso 5 a continuación.
   4. Transfiere 500 μL del cultivo nocturno a un tubo de microcentrífuga y calienta a 100 ± 1 °C durante 10 minutos en un bloque térmico seco.
   5. Enfría a temperatura ambiente y almacena extractos de ADN aislados a -20 °C.
3. Para preparar ADN control positivo, sigue pasos similares a los anteriores para preparar plantillas de ADN a partir de cultivos presuntos de Salmonella con un paso adicional de dilución.
   1. Inocular S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) o cualquier cepa de referencia de Salmonella en una placa de agar no selectiva (por ejemplo, agaro de sangre, agar nutritivo y agar de soja tripticasa) e incubar a 35 ± 2 °C durante 24 ± 2 horas.
   2. Transfiere varias colonias individuales a 5 mL de caldo TSB o BHI e incuba a 35 ± 2 °C durante 16 ± 2 horas para alcanzar ~10⁹ UFC/mL.
   3. Diluye en serie el cultivo nocturno en agua con peptonas al 0,1% para obtener ~^10,7 UFC/mL.
   4. Transfiere 500 μL de esta dilución a un tubo de microcentrífuga y calienta a 100 ± 1 °C durante 10 minutos en un bloque térmico seco.
   5. Enfría a temperatura ambiente y almacena ADN de control positivo a -20 °C.

2. Preparación de la mezcla de imprimación (10 veces)

1. Obtener cebadores LAMP sintetizados comercialmente (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF y Sal4-LB) con purificación estándar por desalación (Tabla 1). Prepara soluciones de base de cada cebador (100 μM) rehidratando el cebador con la cantidad adecuada de agua estéril de grado molecular. Mezcla bien por vórtice durante 10 s y guárdalo a -20 °C (-80 °C para almacenamiento a largo plazo).
2. Prepara la mezcla de imprimación (10 veces) según una hoja de trabajo (Tabla 2). Añade los volúmenes adecuados de soluciones de cebador y agua estéril de grado molecular en un tubo de microcentrífuga. Mezcla bien todos los reactivos haciendo vórtices durante 10 segundos. Alicuota la mezcla de cebador 10x a 500 μL por tubo de microcentrífuga y guárdalo a -20 °C.

3. Ensamblaje de una reacción LAMP

NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, se recomienda encarecidamente separar físicamente las áreas utilizadas para preparar la mezcla maestra LAMP y añadir plantillas de ADN. La Figura 1 es un diagrama LAMP.

1. Preparación y preparación de la carrera
   1. Limpia el banco con isopropanol y una solución degradante de ADN y DNasa (Tabla de Materiales). Limpia pipetas y portatubos para tiras de tubos (Tabla de Materiales) con la solución degradante de ADN y DNasa.
   2. Descongela la mezcla maestra isotérmica, la mezcla de cebador (10 veces), agua de grado molecular, ADN de control positivo y plantillas de ADN a temperatura ambiente.
   3. Enciende el instrumento LAMP (Table of Materials) y toca la pantalla de apertura para acceder a la pantalla de inicio. Sigue estos pasos para crear una carrera.
      NOTA: Un modelo del instrumento LAMP tiene 2 bloques (A y B) con 8 muestras en cada bloque, y otro modelo tiene un solo bloque que acomoda 8 muestras (Tabla de Materiales).
      1. Pulsa LAMP+Recocido y selecciona Editar para introducir la información de la muestra.
         NOTA: El perfil de ejecución por defecto de LAMP consiste en amplificación a 65 °C durante 30 minutos y una fase de recocido de 98 °C a 80 °C con una disminución de 0,05 °C por segundo.
      2. Toca cada fila de muestra para activar el cursor e introduce la información relevante de la muestra, usando el icono del bloque AB para cambiar entre los dos bloques de instrumentos LAMP.
      3. Toca el icono de Checar cuando se haya introducido toda la información de la muestra.
         NOTA: Opcionalmente, la configuración de la ejecución (denominada "Perfil", que contiene información de muestra junto con el perfil de ejecución predeterminado de LAMP) puede guardarse para su uso posterior. Toca el icono de guardar y ponle un nombre único al perfil. Al probar este mismo conjunto de muestras la próxima vez, se puede iniciar una nueva ejecución usando el perfil guardado. Toca el icono de carpeta en la esquina inferior izquierda de la pantalla de inicio y selecciona Perfil para cargar los perfiles guardados.
2. Ensamblaje de reacción LAMP
   NOTA: Al utilizar ambos bloques de instrumentos LAMP (A y B, un total de 16 muestras), preparar la mezcla maestra LAMP para 18 muestras. Si se utiliza solo un bloque de instrumentos LAMP (8 muestras en total), prepara la mezcla maestra LAMP para 10 muestras. Para otros números de muestra, ajusta el volumen en consecuencia para acomodar la pérdida por pipeteo. Incluye siempre un control positivo y un NTC en cada partida de LAMP. Se recomienda realizar pruebas duplicadas de cada muestra en ejecuciones independientes de LAMP.
   1. Prepara la mezcla maestra de LAMP según una hoja de trabajo (Tabla 3). Añade los volúmenes apropiados de la mezcla maestra isotérmica, la mezcla de cebadores y agua de grado molecular en un tubo de microcentrífuga y haz un vórtice suavemente durante 3 segundos. Centrifuga brevemente.
   2. Coloca la tira de tubos en el portatiras y distribuye 23 μL de la mezcla maestra LAMP a cada pozo.
   3. Vierte todas las plantillas de ADN y centrifuga brevemente. Añade 2 μL de plantilla de ADN al pozo correspondiente y tapa firmemente.
   4. Quita la tira del tubo del soporte y mueve la muñeca para asegurarte de que todos los reactivos se han acumulado en el fondo del tubo.
   5. Carga la tira de tubos en el(los) bloque(s) de instrumentos LAMP, asegurándote de que los tapones estén bien asegurados antes de cerrar la tapa.

4. Carrera LAMP

NOTA: Durante una ejecución LAMP, se adquieren lecturas de fluorescencia utilizando el canal FAM. Los valores de tiempo hasta el pico (Tmax; min) son determinados automáticamente por el instrumento para el momento en que la relación de fluorescencia alcanza el valor máximo de la curva de tasa de amplificación. El Tm (°C) es la temperatura de fusión/recocido del producto final amplificado.

1. Haz clic en el icono de Correr en la parte superior derecha de la pantalla y selecciona el(los) bloque(s) que contienen la tira de tubos para iniciar la carrera LAMP.
2. Opcionalmente, mientras la reacción está en curso, pulsa las pestañas Temperatura, Amplificación y Recocido para ver los cambios dinámicos de varios parámetros durante la ejecución del LAMP.
3. Una vez completada la ejecución, toca las pestañas de Amplificación y Recocido para ver las curvas completas de amplificación y recocido, y toca la pestaña Resultados para ver los resultados.
4. Opcionalmente, para el registro, registra el número de ejecución situado en la parte superior izquierda de la pantalla, usando el formato de "número de number_run de serie de instrumentos", por ejemplo, "GEN2-2209_0030."

Tabla 1: Cebadores LAMP para el cribado de Salmonella en alimentos animales y la confirmación de Salmonella a partir de aislamiento en cultivo. Los cebadores están diseñados basándose en la secuencia Salmonella invA (número de acceso GenBank M90846).

Nombre de la guía	Descripción	Secuencia (5'-3')	Longitud (pb)
Sal4-F3	Cebador exterior frontal	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	Cebador exterior al revés	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Imprimación interior hacia adelante	GCGCGGCATCCCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Cebador interior al revés	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Cebador de lazo hacia adelante	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Cebador hacia atrás	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tabla 2: Hoja de trabajo para preparar la mezcla de imprimación LAMP (10 veces). Los cebadores se enumeran en la Tabla 1.

Componente	Conc. de culata (μM)	Mezcla de imprimación condensada (μM)	Volumen (μL)
Imprimación Sal4-F3	100	1	10
Imprimación Sal4-B3	100	1	10
Imprimación Sal4-FIP	100	18	180
Introducción a Sal4-BIP	100	18	180
Imprimación Sal4-LF	100	10	100
Imprimación Sal4-LB	100	10	100
Agua de grado molecular	N/A	N/A	420
Total	N/A	N/A	1000

Tabla 3: Hoja de trabajo para preparar la mezcla de reacción LAMP. La mezcla de cebadores (10x) se prepara según la Tabla 2 utilizando soluciones estándar de cebadores listados en la Tabla 1.

Componente	Trabajando en conc.	Reacción final conc.	Volumen por muestra (μL)	Volumen para 18 muestras (μL)	Volumen para 10 muestras (μL)
Mezcla maestra isotérmica ISO-001	1,67x	1x	15	270	150
Mezcla de imprimación	10x	1x	2.5	45	25
Agua de grado molecular	N/A	N/A	5.5	99	55
Subtotal de mezcla maestra	N/A	N/A	23	414	230
Plantilla de ADN	N/A	N/A	2	N/A	N/A

Resultados

Figura 1: Un diagrama esquemático del flujo de trabajo Salmonella LAMP.

Materiales