Entrega por electroporación de biomoléculas fluorescentes en células bacterianas

Resumen

Fuente: Aigrain, L., et al. Internalización y observación de biomoléculas fluorescentes en microorganismos vivos mediante electroporación. J. Vis. Exp. (2015)

El vídeo demuestra la entrega de biomoléculas fluorescentes en células microbianas electrocompetentes mediante electroporación. El proceso comienza con la introducción de ADN o proteínas marcadas con fluoróforo en una suspensión celular refrigerada. A continuación, se aplica un pulso de alto voltaje para crear poros temporales de membrana, permitiendo la entrada de biomoléculas en el citoplasma. Tras la recuperación, las células se someten a lavado y filtración para eliminar moléculas no internalizadas o unidas a la superficie. Finalmente, las células marcadas se montan para imágenes de fluorescencia que visualizan los componentes intracelulares.

Protocolo

1. Electroporación

1. Incubación
   1. Añadir hasta 5 μl de moléculas marcadas almacenadas en un tampón bajo en sal (< 50 mM de sal) a una única alitería de células competentes (20 μl bacterias o 50 μl levaduras) e incubar durante 10 minutos sobre hielo.
      NOTA: La concentración de moléculas marcadas con fluorescencia en las soluciones estándar y, por tanto, la cantidad de moléculas marcadas añadidas a la célula antes de la electroporación están directamente correlacionadas con la eficiencia de carga (Figura 1 y Discusión). Como algunas proteínas son menos compatibles con condiciones bajas en sal, la concentración de sal en el tampón de almacenamiento puede aumentar, pero entonces debe disminuir el volumen de moléculas marcadas añadidas a las células antes de la electroporación.
   2. Transfiere la mezcla de células y biomoléculas marcadas a una cubetas de electroporación preenfriada (espaciado de 0,1 y 0,2 cm para bacterias y levaduras, respectivamente). Golpea suavemente la cubetas sobre el banco para eliminar posibles burbujas de la solución.
   3. Colocar la cubetas en el electroporador y aplicar un pulso eléctrico de alta tensión a la solución (0,9 a 1,8 kV/cm, véase la Discusión para más detalles sobre cómo elegir voltaje). Este pulso forma poros transitorios en las membranas celulares, permitiendo que las biomoléculas marcadas difundan dentro de las células.
   4. Comprueba que la constante de tiempo mostrada en el electroporador esté entre 4 y 6 ms. Las constantes de tiempo más bajas suelen deberse a una concentración de sal demasiado alta y/o a la presencia de burbujas en la cubeta, lo que conduce a una carga muy baja o nula de las celdas.
2. Recuperación
   1. Inmediatamente después de la electroporación, añade 500 μl de medio rico como caldo Super Óptimo con represión catabolita (SOC), medio definido rico en EZ, extracto de levadura Peptona Dextrosa (YPD) o cualquier medio rico a las células.
   2. Incuba la muestra a 37 °C para bacterias y 29 °C para levaduras durante 2 a 10 minutos. Para mediciones de viabilidad, donde el usuario quiere evaluar el porcentaje de células que crecen y se dividen tras la electroporación, se utiliza un tiempo de recuperación más largo (hasta 1 hora), ya que observamos esos tiempos de retraso antes de la primera división celular.
3. Pasos de lavado
   1. Lava las células para eliminar cualquier biomolécula no internalizada centrifugándolas durante 1 minuto a 3300 x g y 4 °C. Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender las células en solución salina fosfatada (PBS) de 500 μl.
      NOTA: Para cada muestra, prepara un control negativo de células incubadas con la misma cantidad de biomoléculas marcadas pero no electroporadas ni lavadas exactamente de la misma manera que la muestra principal.
   2. Repite los pasos anteriores 3 veces.
   3. En el caso de la internalización de proteínas, optimizar el procedimiento de lavado según las propiedades y el comportamiento de la proteína marcada de interés. Los siguientes pasos son ejemplos de posibles optimizaciones:
      1. Realiza los tres primeros ciclos de lavado usando PBS que contiene 100 mM de NaCl y 0,005% de Triton X-100 para eliminar proteínas no internalizadas que puedan adherirse a la membrana celular externa.
         1. Filtrar las celdas electroporadas con un filtro de 0,22 μm de diámetro de poro instalado dentro de un tubo microcentrífuga de 1,5 ml, pipeteando las células electroporadas dentro del filtro. Centrifuga durante 3 minutos a 800 x g y 4 °C. Descarta el flujo directo. Añade 500 μl de nuevo PBS sobre las celdas y haz girarlas de nuevo como antes, repitiendo estos pasos una vez.
      2. Añadir una pequeña cantidad de proteasa K (10 ng en 500 μl PBS) durante el primer ciclo de lavado para permitir la digestión de cualquier proteína no internalizada.
   4. Centrifuga las células durante 1 minuto a 3300 x g y 4 °C. Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender las células en 150 μl de PBS.
   5. Esparce la solución de la celda cargada sobre la almohadilla de agarosa retirando la cubierta superior y esparciendo 10 μl de la célula gota por gota. Sustituye una cubierta limpia y quemada sin usar (no de grosor 1,5, que coincida con la especificación del objetivo del microscopio) en la parte superior de la almohadilla y presione muy suavemente la lámina.
   6. Protege las células electroporadas de la luz almacenando las almohadillas en una caja opaca mientras se toman imágenes de diferentes muestras.

Resultados

Figura 1: Contando el número de moléculas internalizadas mediante análisis de fotoblanqueamiento. (A) Análisis de blanqueamiento fotocelular único. Ejemplos de rastros de tiempo de intensidad de fluorescencia (azul: datos ...

Materiales