Preparación de muestras de Myxococcus xanthus para imagen de células vivas

Resumen

Fuente: Schumacher, D., et al. Imagen de células vivas por fluorescencia del ciclo celular vegetativo completo de la bacteria social de crecimiento lento Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo muestra la preparación e imagen de Myxococcus xanthus, una bacteria del suelo de crecimiento lento. El cultivo se cultiva en un medio medio, se aplica sobre una capa con microesferas fluorescentes y se recubre con una almohadilla de agarosa precalentada para apoyar la hidratación y el suministro de nutrientes. Esta configuración permite la obtención de imágenes en vivo a largo plazo y en lapso de tiempo de los procesos celulares durante la división celular bacteriana.

Protocolo

1. Preparación de muestras de microscopía

Nota: Las células que se van a observar mediante microscopía se colocan sobre un tobogán de microscopio y luego se cubren con una almohadilla de agarosa que contiene nutrientes. La cubierta se pega a un marco de plástico o metal para proporcionar soporte mecánico. En preparación para la microscopía, se debe preparar con antelación una gran almohadilla de 1% de agarosa/TPM/0,2% CTT, tal y como se describe en los pasos 2.1 - 2.3. Por favor, consulte también la Tabla de Materiales para los productos específicos utilizados aquí.

1. Preparar 500 mL de tampón TPM (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM_{KH, 2}PO₄ pH 7,6, 8 mM_{MgSO 4}) y esterilizar con autoclave o filtro usando un filtro de botella.

NOTA: El tampón estéril puede almacenarse durante varios meses a temperatura ambiente.

2. Preparar una solución microscópica de agarosa al 1% que contenga 0,2% de CTT (mezclar 1 g de agarosa con 80 mL de tampón TPM y 20 mL de medio CTT al 1%). Calienta en un microondas hasta que la agarosa esté fundida.

NOTA: El 0,2% de CTT es suficiente para permitir el crecimiento de las células y prevenir la inanición. Concentraciones más altas de CTT en el medio de microscopía resultarán en una alta fluorescencia de fondo.

3. Llenar una placa de Petri con la agarosa fundida hasta un grosor de 0,5 cm (para una placa de Petri de 11,5 cm x 11,5 cm cuadrados, se requieren aproximadamente 60 mL de agarosa fundida) y dejar que se enfríe hasta temperatura ambiente.

NOTA: La almohadilla de agarosa puede almacenarse a 4 °C en un ambiente húmedo durante hasta 2 días.

1. Precalentar la compresa al 1% de agarosa/TPM/0,2% CTT a 32 °C durante al menos 15 minutos antes de su uso.

NOTA: Para preparar las células para la microscopía, sigue los pasos 2.4 - 2.8.

4. Colocar una capa de cubierta de vidrio estéril (60 mm x 22 mm, grosor: 0,7 mm) sobre un marco de plástico o metal que tenga un agujero en el centro (Figura 1A); Este marco sirve como soporte mecánico para el delgado desliz de cobertura y ayuda a reducir la deriva durante la microscopía. Fija la cubierta al marco con cinta adhesiva.

1. Para preparar el marco, cortar un marco de 75 mm × 25 mm de una placa metálica de 1 mm de grosor y luego cortar un agujero del tamaño adecuado (20 mm × 30 mm en este experimento) en el centro.

5. Añadir de 10 a 20 μL de células de M. xanthus crecidas exponencialmente sobre el cubrimiento.

6. Añadir microesferas fluorescentes de 0,5 μm como marcadores fiduciales a las células para simplificar el seguimiento de células o proteínas en grabaciones de lapso de tiempo.

1. Diluir las microesferas 1:100 en un tampón TPM y almacenarlas a 4 °C durante varios meses. Agita bien antes de usarlo y añade entre 5 y 10 μL de las microesferas diluidas a las células.

NOTA: Aquí se utilizaron microsferas fluorescentes en todos los canales fluorescentes comunes azul, verde, amarillo y rojo.

7. Cortar una pequeña almohadilla aproximadamente del tamaño del cubrimiento de la almohadilla grande precalentada de agarosa/TPM/0,2% CTT y colócala sobre las celdas (Figura 1B). Coloque una capa de cobertura sobre la almohadilla de agarosa al 1%/TPM/0,2% CTT para evitar la evaporación y mantener las células en un ambiente húmedo.

NOTA: El cobertizo por sí solo evitará una evaporación significativa durante al menos 2 horas. Para grabaciones en lapso de tiempo largos, la almohadilla de agarosa/TPM/0,2% CTT y el sándwich de coverslip deben sellarse con película de parafina para evitar la evaporación.

8. Incubar la muestra de microscopía a 32 °C durante 15 - 20 minutos para permitir que las células se adhieran al fondo de la almohadilla de agarosa. Luego comienza las grabaciones de microscopía en time-lapse.

Resultados

Figura 1: Esquema del montaje experimental utilizado a lo largo de este estudio. (A) Un marco metálico o de plástico sirve como soporte para la muestra. Un portaobjetos se fija al marco metálico con cinta adhesiva para reduc...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMI6000B con AFC	Microsistemas Leica	11888945	Microscopio automatizado de fluorescencia de campo amplio invertido con control de enfoque adaptativo
Marco de montaje universal	Microsistemas Leica	11532338	Soporte de escenario para diferentes tamaños de muestra
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 aceite PH3	Microsistemas Leica	11506197	Objetivo de contraste de fase
Cámara Orca Flash 4.0	Hamamatsu	11532952	Cámara sCMOS de 4,0 megapíxeles para adquisición de imágenes
Set de filtros TXR ET, k	Microsistemas Leica	11504170	Juego de filtros de fluorescencia, Ej: 560/40 Em: 645/75
Conjunto de filtros L5 ET, k	Microsistemas Leica	11504166	Conjunto de filtro de fluorescencia, Ej: 480/40 Em: 527/30
Conjunto de filtros YFP ET, k	Microsistemas Leica	11504165	Juego de filtros de fluorescencia, Ej: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Previo	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Controlador de automatización de microscopio con centro de control interactivo
Fuente de luz EL 6000	Microsistemas Leica	11504115	Fuente de luz de fluorescencia externa
Incubadora BLX Black	Pecon	11532830	Cámara negra de incubación que rodea el microscopio
Tempcontrol 37-2 digital	Microsistemas Leica	11521719	Control automatizado de temperatura para cámara de incubación
Sulfato de gentmicina	Carl Roth	233.4	Gentamicina
Oxitetracilina dihidratada	Sigma Aldrich	201-212-8	Oxitetraciclina
Sulfato de kanamicina	Carl Roth	T832.3	Kanamicina
Filtro de botella Filtropur BT25 0.2	Sarstedt	831,822,101	Filtro de botella para esterilizar los tampones
Deckgläser	VWR	630-1592	Engobe de cubierta de vidrio (60 x 22 mm, grosor: 0,7 mm)
Agarosa Seakem LE	Lonza	50004	Agarosa para portaobjetos de microscopía
Leica Metamorph AF	Microsistemas Leica	11640901	Software de control de microscopio y software para análisis de imágenes
Microsparas Tetraspeck, 0,5 μm	ThermoFisher	T7281	Microsferas fluorescentes
placa de Petri	Greiner Bio-one	688102	Placa de Petri cuadrada de 120 mm x 120 mm x 17 mm para almohadillas de agarosa
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(hidroximetil)-aminometano	Carl Roth	AE15.2	Tris
Sulfato de magnesio heptahidratado	Carl Roth	P027.2	Sulfato de magnesio
Fosfato de dihidrógeno potásico p.a.	Carl Roth	3904.1	Dihidrógeno fosfato de potasio
Medio CTT al 1%: 1 % (p/v) BD Bacto™ casitona, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM tampón fosfato potásico pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Medio de cultivo para M. xanthus
Tampón TPM: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM tampón de fosfato de potasio pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Buffer para la preparación de portaobjetos de microscopía para M. xanthus